[发明专利]用于检测塞尼卡谷病毒的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒及其应用

说明书

本发明公开了一种用于检测塞尼卡谷病毒的Taqman实时荧光定量RT‑PCR试剂盒及其应用。所述的试剂盒包含用于检测塞尼卡谷病毒的引物以及探针，优选的，所述试剂盒中还包含核酸提取液、2×Direct qRT‑PCR Mix、酶混合液、阴性对照、阳性对照。使用本发明的试剂盒检测塞尼卡谷病毒，具有特异性高，灵敏度高，稳定性好，操作简便等优点，用户无需额外提取病毒RNA，无需反转录，只需将待检样品加入反应管中，利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，即可计算待检样品拷贝数。不仅适用于科研单位定量分析，而且适合于各级防控单位，基层兽医站，大中型养殖场等的病原检测分析，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种病毒检测试剂盒及其应用，特别涉及一种用于检测塞尼卡谷病毒的一步直扩Taqman实时荧光定量RT-PCR(探针法实时-定量聚合酶链反应)试剂盒，本发明还涉及该试剂盒在检测塞尼卡谷病毒中的应用。本发明属于分子生物学检测技术领域。

背景技术

塞尼卡谷病毒(Seneca valley virus，SVV)感染猪能引起猪的原发性水泡病，临床症状与口蹄疫无法区别。SVV先后在美国(2015、2016、2017年)、加拿大(2007、2011、2015、2016年)、巴西(2014、2015年)、哥伦比亚(2016年)、中国(2015、2016、2017年)和泰国(2016年)等国家引发疫情。2015年，传入中国以来，2015-2016年呈散发，2017年以来，SVV先后在福建、广东、广西、河南(11个县区)、河北、山东、辽宁等省迅速扩散开来，引起大量猪场发病，且存在SVV和FMDV混合感染病例。然而，至今SVV的流行原因仍然不明，还没有商品化的疫苗和诊断试剂可用，SVV仍然处于失控状态，SVV防控形式严峻。并且因临床发病症状与口蹄疫相似，且能混合感染，对口蹄疫防控形成严重干扰。

常规的病原学诊断方法主要有病毒的分离与鉴定、病毒抗原检测等，每种诊断方法都有其适用的范围。用常规病原学方法对血液、淋巴结等病毒含量低微的样品进行检测，往往得不到正确的结果。已有的RT-PCR检测方法只能进行定性检测不能做精确定量分析，且扩增后需要经过电泳判断结果，每次检测的样品数量较少、对低含量的样品分辨率不足。

本发明针对目前的现状，在长期研究的基础上，建立并优化出一种简捷、廉价、敏感的Real-Time RT-PCR SVV检测方法，并组装成试剂盒。该方法无需体外使用RNA提取试剂盒提取RNA、无需反转录，在同一反应管内就可完成反转录和PCR的过程，通过荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进行定量分析，结果更为准确直观，且无需电泳观察结果。大大缩短了时间和减少了污染的机率。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术不能适应快速、敏感和准确及定量检测塞尼卡谷病毒的缺点，从而提供一种能够快速、敏感、准确以及定量地检测塞尼卡谷病毒的Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒，本发明还提供该试剂盒的使用方法。

为解决上述问题，本发明采用了下述技术方案：

本发明的一种用于检测塞尼卡谷病毒的一步直扩Taqman实时荧光定量RT-PCR试剂盒，其包含用于检测塞尼卡谷病毒的引物以及探针，其中所述的引物由上游引物和下游引物组成，上游引物的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，下游引物的核苷酸序列如SEQ IDNO.2所示，所述的探针的核苷酸序列如SEQ ID NO.3所示。

其中，优选的，所述的试剂盒中还包含核酸提取液、2×Direct qRT-PCR Mix、酶混合液、阳性对照以及阴性对照。

其中，优选的，所述探针的5’端标记荧光报告基团；所述探针的3’端标记小沟结合物和荧光淬灭基团。