[发明专利]糖苷类化合物的甲基化转移酶基因

说明书

本发明涉及一类糖苷类化合物的甲基转移酶基因，可将糖苷类化合物中糖基的4位羟基进行甲基化修饰，同时可以同萄糖基转移酶协同作用，通过组合生物合成转化包括聚酮类、黄酮类、蒽醌类等在内的不同活性物质，从而获得有别于这些天然产物结构的新型活性化合物，实现化合物的定向生物转化，增强化合物的稳定性。

技术领域：

本发明涉及一种可将糖基化物质中的葡萄糖4位羟基甲基化的基因，所述糖基化物质具体包括聚酮类、黄酮类、蒽醌类等多酚类化合物的糖基化衍生物。

背景技术：

各种天然及非天然的糖基化物质容易受到来自生物体及外界的多种因素的影响，导致自身降解，活性降低。如果将这些物质中糖基的4位羟基烷基化，有利于增强其稳定性。

真菌生物转化是利用细胞内特定的酶对外源化合物进行结构修饰与改造，从而获得更有价值的代谢反应。

发明内容:

本发明的目的是获得可参与糖基化合物中糖基的4位羟基甲基化的O-甲基转移酶基基因，实现糖基化化合物的甲基化修饰，获得新型结构及活性的天然产物，增强其稳定性。

一种甲基转移酶在糖苷类化合物甲基化修饰中的应用，所述甲基转移酶具有如下二级结构：

从N端开始，3个(α+β串联)+β折叠+3个(α+β串联)+β折叠；

且，它们的氨基酸序列选自SEQ ID NO.2、4、6、8或10。

具体的，本发明从球孢白僵菌、玫烟色棒束孢Isaria fumosorosea、罗伯特绿僵菌Metarhizium robertsii、紫色麦角菌Claviceps purpurea和蛹虫草CordycepsmilitarisCM01中发现了以下五个特殊的O-甲基转移酶，分别命名为BbFkbM、CpOMT、MrOMT、IfOMT和CmOMT。这五个蛋白均具有相同的motif和排布方式(见图30-32)，且活性中心的氨基酸序列一致性很高，极性相符。

通过cDNA分别扩增葡糖O-甲基转移酶基因BbFkbM、通过DNA合成得到CpOMT、MrOMT、IfOMT和CmOMT，分别构建可在酵母菌中表达的重组质粒，同实验室已有的葡糖基转移酶异源表达载体共转入酵母，并在酵母中进行异源表达转化。

通过外源添加不同糖基化衍生物，或与葡糖基转移酶进行组合生物合成，从发酵产物中提取得到了与原化合物结构不同的糖甲基化产物。

经实验证实，本发明的五个O-甲基转移酶基因通过异源表达，可对多种黄酮类、聚酮类、蒽醌类的糖基化衍生物进行甲基化修饰，所得到的产物较未修饰前水解稳定性增强，可抵消酵母中糖苷水解酶的降解作用，增强了在生物体内的稳定性。而且，这些同源基因不仅具有相同的功能，还可与不同的糖基转移酶进行组合生物合成，修饰不同的天然活性产物，并提高转化效率，为先导化合物的发现及药物的定向转化提供了新的研究方法与途径。

以BbFkbM为例，说明如下具体研究过程：

1、获得BbFkbM基因

通过基因组测序和相关预测软件对糖基转移酶的结构分析，设计引物，由cDNA扩增获得球孢白僵O-甲基转移酶基因BbFkbM。其中，BbFkbM核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

2、葡糖基转移酶BbFkbM酵母表达载体构建与酵母转化

将含有完整的BbFkbM的DNA片段连接到PXW06F载体上，构建了组成型表达质粒PXW06F-BbFkbM，同时和葡糖基转移酶异源表达载体PRS425m-BbUGT86转入营养缺陷型酵母受体BJ5464进行异源表达。

3、重组子的筛选共同

将表达载体转入不能合成亮氨酸、色氨酸的缺失酵母菌中，利用亮氨酸、色氨酸营养缺陷型标记筛选重组子。