[发明专利]糖基转移酶及其相关材料在构建产人参皂苷Rb1和Rg1的工程菌中的应用

说明书

本发明公开了糖基转移酶及其相关材料在构建产人参皂苷Rb1和Rg1的工程菌中的应用。本发明通过合成生物学的方法成功鉴定到催化人参皂苷Rd生成人参皂苷Rb1的糖基转移酶基因Pn3‑32，此基因同时可以催化人参皂苷F1生成人参皂苷Rg1，并构建得到产人参皂苷Rb1和Rg1的重组酵母菌。通过实验证明：本发明构建的产人参皂苷Rb1和Rg1的重组酵母菌可同时生成人参皂苷Rb1和人参皂苷Rg1。本发明首次利用药用植物三七中Pn1‑31、Pn3‑29、Pn3‑31和Pn3‑32四个糖基转移酶基因连续催化原人参二醇和原人参三醇合成人参皂苷Rb1、人参皂苷Rg1及相应中间体，为微生物菌株生产天然产物提供新案例。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及糖基转移酶及其相关材料在构建产人参皂苷Rb1和Rg1的工程菌中的应用。

背景技术

人参皂苷Rb1(Ginsenoside Rb1)、人参皂苷Rd(Ginsenoside Rd)和人参皂苷Rg1(Ginsenoside Rg1)均为达玛烷型三萜皂苷类化合物，主要分布于五加科植物人参、三七、西洋参等植物中，具有多种药理活性，是极具药用价值的化学物质。其中人参皂苷Rb1在中枢神经系统、心血管系统、免疫系统以及在抗肿瘤方面具有改善调节作用。人参皂苷Rd在心血管系统、免疫系统、肾脏功能保护及抗肿瘤作用等方面有着显著生物活性。人参皂苷Rg1具有天然抗氧化作用，对神经系统、心血管系统、免疫系统都有影响，可以抑制细胞凋亡、扩张血管、抗衰老，并对运动疲劳的恢复有一定作用。这类化合物主要是从人参属植物中分离提取得到，但这种方法有较多的缺点，包括含量低和差异大，产品纯化难，植物生长周期长，对生物资源尤其野生资源造成严重破坏等。

目前利用合成生物学的原理，设计和改造微生物菌株来生产天然产物已被国际认为是一种最有潜力的方法，如在大肠杆菌中生产紫杉醇的前体紫杉二烯已达到1000mg/L(Parayil Kumaran Ajikumar et al.,2010,Science,330:70-74)；银杏内酯类(Ginkgolides)前体左旋海松二烯(Levopimaradiene)，在改造后的大肠杆菌工程菌中达到700mg/L的产量(Effendi Leonard et al.,2010,PNAS,107(31):13654–13659)；在酵母工程菌中生产青蒿素(Artemisinin)的前体青蒿酸(Artemisinic acid)最高达到25g/L(Paddon CJ et al.,2013,Nature,2013,496:528-532)；目前国内在青蒿素、紫杉醇、人参皂苷和丹参酮等药物分子的生物合成方面均有相关研究。

然而，清晰的天然药物生物合成过程是应用合成生物学技术创建人工细胞工厂发酵生产目标化合物的前提。目前在人参皂苷的生物合成途径研究方面已有相关进展，包括人参皂苷合成途径中的一些关键酶，如催化类异戊二烯途径朝向固醇和三萜皂苷的角鲨烯合酶(Squalene synthase，SS)，催化2，3-氧化角鲨烯生成的角鲨烯环氧酶(Squaleneepoxidase，SE)，催化达玛烯二醇生成的达玛烯二醇合成酶(DS)，还有负责羟基化的细胞色素P450酶等，但三七中各类糖基化皂苷的生物合成比较复杂，目前尚未完全挖掘。钟建江等在钙离子对三七人参皂苷Rb1生物合成影响的研究中发现三七植物组织细胞中提取的粗酶液有催化人参皂苷Rd生成人参皂苷Rb1的活性，但并未找到相关糖基转移酶基因(Yue CJet al.,Biotechnol Bioeng,2005,89(4):444-452)。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种蛋白质。

本发明提供的蛋白质是如下a)或b)或c)或d)的蛋白质：

a)氨基酸序列是序列2或序列16或序列17或序列18所示的蛋白质；

b)在序列2或序列16或序列17或序列18所示的蛋白质的N端和/或C端连接标签得到的融合蛋白质；