[发明专利]菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法

说明书

本发明公开了一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法，涉及定量PCR领域，该方法以菊芋不同组织(幼根、嫩茎、叶、茎块和花瓣)为材料，使用q PCR技术开展18S核糖体RNA基因(18S rRNA)、转录延伸因子基因(Ef‑1a)、肌动蛋白基因(Actin、β‑actin)、3‑磷酸甘油醛脱氢酶基因(GAPDH)、25S核糖体RNA基因(25S rRNA)、多聚泛素酶基因(UBQ)7内参基因的表达量分析，并利用GeNorm和NormFinder软件对所获得的数据进行统计学上的评估，分析各看家基因的表达变化，以期筛选出相对稳定的基因作为菊芋的内参基因，用于研究菊芋基因量的变化。

技术领域

本发明涉及定量PCR领域，特别涉及一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法。

背景技术

实时定量PCR(quantitative real-time PCR，qPCR)是利用实时荧光定量仪，来检测PCR反应后产物的量，以达到对核酸定量的目的。与传统的RNA定量技术相比，它对于探测低拷贝数的mRNA更加灵敏。实现了聚合酶链式反应技术(polymerase chain reaction，PCR)从定性到定量的飞跃，具有定量准确性高、重复性好、灵敏度强、速度快等优点。随着基因组学以及高通量测序技术的发展，在分子生物学领域中实时荧光定量PCR已经成为分析基因表达特性的重要工具。利用qPCR分析基因相对定量表达时，为了消除不同组织细胞间初始模板量、RNA质量、酶促反应效率等偏差，往往需要引入内参基因对其进行校正。

鉴于qPCR的众多优点，在植物科学领域中，越来越多的研究者利用实时荧光定量技术筛选合适的内参基因，以进行基因表达和转录组分析。理想的内参基因应该满足以下条件：首先在不同种类的组织、细胞以及不同的发育时期都能表达稳定；另外，其表达受环境、生物、非生物胁迫等各种因素的影响较小；再者，不存在假性基因的情况，以避免基因组DNA的扩增；最后其稳定表达值与目的基因的表达值相近。但到目前为止，尚未发现一种内参基因能够完全满足上述条件，因此在具体、可复制的实验条件下，挑选表达稳定的内参基因是进行qPCR分析的重要前提。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法，对所获得的数据进行统计学上的评估，分析各看家基因的表达变化，以期筛选出相对稳定的基因作为菊芋的内参基因，用于研究菊芋基因量的变化。

为实现上述目的，本发明提供以下的技术方案：一种菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法，其特征在于：所述菊芋实时定量PCR分析中内参基因的选择方法的步骤如下：

(1)总RNA的提取：称取100mg菊芋叶片或块茎组织放入预冷好的研钵中，在液氮中快速研磨成粉状后移至盛有1mL Trizol的1.5mL无酶离心管中，将匀浆样品在室温下，放置5min，加200ul氯仿，盖好管盖，在涡旋振荡器上剧烈震荡15sec左右，然后室温静置3min，12000r·min^-14℃离心10min，样品会分成三层，将上层透明的水相(500ul)转移到新的无酶离心管中，加入500u1的异丙醇，混匀后在室温下放置20min，12000r·min^-14℃离心10min，去上清，沉淀用1mL75％的乙醇洗涤2次，短暂离心后倒出液体，晾干后加入30uL RNase·Free ddH2O，吹打混匀，之后用TGem Plus全波长分光光度计测定总RNA的浓度和纯度，再用1.0％的琼脂糖凝胶电泳检测总RNA的完整度；

(2)反转录c DNA第一链的合成：按照M-MuLV第一链cDNA合成试剂盒的操作方法，将各样品总RNA反转录合成cDNA第一链，反转录体系为20μL，获得的cDNA产物直接用于PCR或-80℃贮藏备用；