[发明专利]哌拉西林单克隆抗体的制备方法及应用

权利要求书

1.一种哌拉西林单克隆抗体的制备方法，其特征在于：利用杂交瘤细胞株制备，具体步骤如下：

1.1饲养细胞的制备：

取6-10周龄Balb/c小鼠，拉颈处死，浸泡于酒精内，消毒3-5min；转入无菌操作台中，用无菌剪刀剪开皮肤，使其腹膜充分暴露；用无菌注射器注入预冷的无血清1640培养液，用轻轻拍动小鼠腹腔，吸出培养液，放入离心管，离心；弃掉上清，用完全培养液重悬饲养细胞，计数，并调整细胞数至2×105个/mL，将饲养细胞加入96孔板中，每孔100μL，然后放入37℃的CO₂培养箱培养；

1.2杂交瘤细胞融合及有限稀释法亚克隆筛选

a.制备免疫B细胞：将免疫后的小鼠摘眼球放血，收集血液后处死；无菌分离取出小鼠脾脏置于含有无血清1640培养液的平皿中，以无血清1640培养液润湿铜网，在培养皿中碾碎脾脏并以铜网过滤制备B细胞悬液，补充无血清培养液体积至40mL；将B细胞悬液离心，弃上清；重复以上步骤，再洗一次；

b.制备骨髓瘤细胞：取培养与250mL培养瓶中的对数生长期骨髓瘤细胞SP2/0细胞1-2瓶，吹打细胞调整体积至40mL，转入50mL无菌离心管中，离心，弃上清，重复以上步骤，再洗一次；

c.按照1/10—1/5的比例混合SP2/0骨髓瘤细胞与免疫B细胞，补加不完全1640培养液至40mL，1000r/min离心10min清洗一次；

d.倾出上清液，吸净残留液体，轻弹管壁，使细胞疏松呈糊状；

e.将含融合细胞的离心管置于37℃水浴，吸取0.8mL 37℃预温的PEG 4000，缓慢滴入管内，边加边旋转，60s内滴完，37℃静置90s以上；

f.然后5min内加入10mL 37℃预温的不完全培养基，第一分钟加1mL、第二分钟加1mL、第三分钟加1.5mL、第四分钟加1.5mL、第五分钟加完、最后补至30mL，于37℃静置5min，1000r/min离心6min；弃掉上清，缓慢加入20mL完全培养液，轻柔搅拌混匀后补足完全培养液至40mL，加入1×HAT培养基，分至4板已铺好饲养细胞的96孔板中，未加融合细胞的孔为阴性对照；

g.5天后每孔补充50μL含1×HT培养基的完全培养液；

h.当融合细胞，铺满1/4孔底时，不需换液，直接通过IELISA检测杂交瘤细胞抗体分泌情况；

i.对得到的阳性孔进行复查和亚类鉴定，复查阳性并且亚类为IgG的细胞株用有限稀释法进行克隆化筛选，计数200个细胞以梯度铺板法铺于一块96孔板；

j.根据后续ELISA检测结果，进行3-5次克隆化筛选，至所有有细胞的孔均为阳性，则得到单克隆杂交瘤细胞株，进行扩大培养；

k.将抗体分泌阳性的克隆转入24孔板，进一步转种入培养瓶中扩大培养，冻存部分克隆细胞，同时进行克隆化培养；

l.用IELISA方法对杂交瘤细胞培养上清进行交叉筛选；

m.制备饲养细胞层100μL/孔，2×104个/孔，用无菌吸管吹打培养板中的克隆，悬浮于完全培养液，调整细胞浓度至10-20个/mL，加1×HT培养基，加入含饲养细胞的培养板中，100μL/孔，使每孔含有1-2个细胞，在培养箱中培养8-12天，当杂交瘤细胞铺满1/4孔底时，取上清检测；阳性孔再进行克隆化培养至100％克隆分泌特异性抗体为止，大量扩大培养，并标记好冻存于液氮罐中，记录冻存位置。