[发明专利]基于干酪乳酸杆菌L.casei 393制备水溶性纳米硒微球的方法

权利要求书

1.一种基于干酪乳酸杆菌L.casei 393制备水溶性纳米硒微球的方法，其特征在于：L.casei 393经厌氧富硒发酵将毒性的亚硒酸钠转化为无毒的红色单质纳米硒，并将其富集于菌体细胞内，对发酵产物中的富硒菌体进行分离提取得到水溶性纳米硒微球，具体步骤如下：

步骤1、用MRS固体培养基对干酪乳酸杆菌L.casei 393菌株进行活化培养：将L.casei393划线接种于MRS固体培养基，于37±1℃厌氧培养48±1h；

所述MRS固体培养基配方如下：蛋白胨1±0.1％，牛肉1±0.1％，酵母膏0.5±0.01％，柠檬酸氢二铵0.2±0.01％，葡萄糖2±0.1％，乙酸钠0.5±0.01％，磷酸氢二钾0.2±0.01％，七水硫酸镁0.06±0.01％，一水硫酸锰0.025±0.01％，吐温80 0.1±0.01％，琼脂2±0.1％，pH 6.2-6.6；

步骤2、厌氧富硒培养：将活化后的干酪乳酸杆菌L.casei 393的单菌落用MRS液体培养基，37±1℃静置培养24±1h后，向培养基中加入终浓度为1.2mM的亚硒酸钠，继续37±1℃静置厌氧培养24±1h，将毒性的亚硒酸钠转化为无毒的红色单质纳米硒，并将其富集于菌体细胞内得到发酵产物；

MRS液体培养基配方如下：蛋白胨1±0.1％，牛肉1±0.1％，酵母膏0.5±0.01％，柠檬酸氢二铵0.2±0.01％，葡萄糖2±0.1％，乙酸钠0.5±0.01％，磷酸氢二钾0.2±0.01％，七水硫酸镁0.06±0.01％，一水硫酸锰0.025±0.01％，吐温80 0.1±0.01％，pH 6.2-6.6；

步骤3：采用溶菌酶处理、超声破碎及有机-水相萃取系统相结合的方法对发酵产物中富集的纳米硒进行分离提取，得到水溶性纳米硒微球。

2.根据权利要求1所述的方法，其特征在于：所述采用溶菌酶处理、超声破碎及有机-水相萃取系统相结合的方法对发酵产物进行分离提取得到水溶性纳米硒微球的步骤如下：

步骤1)：将培养的干酪乳酸杆菌L.casei 393发酵液，于高速冷冻离心机10000±1000rpm，4±1℃离心10±1min，弃上清，将菌体重悬于无菌水；

步骤2)：向菌体重悬液中加入溶菌酶，使其浓度为10±1mg/mL，混匀后于37±1℃水浴2±0.5h；

步骤3)：使用超声破碎仪破碎菌体，破碎条件：300±50W，开2s、停2s，时长20min；

步骤4)：将破碎液于高速冷冻离心机10000±1000rpm，4±1℃离心10±1min，弃上清；

步骤5)：收集步骤4中超声破碎液离心后所得的沉淀，用含有1％SDS的1.5MTris-HCl(pH 8.3)，充分振荡混匀后，于高速冷冻离心机10000±1000rpm，4±1℃离心10±1min，连续离心洗涤3-4次；

步骤6)：将步骤5中所得的沉淀再重悬于无菌水中，得到的重悬液中包含纳米硒和细胞碎片；

步骤7)：重悬液转入无菌离心管中，向每4mL的重悬液加入2mL的正辛醇，涡旋振荡，使有机相与液相充分混匀；

步骤8)：将混合液于高速冷冻离心机2000±100rpm离心5±1min后，转移到4±1℃冰箱，静置24±1h，细胞碎片悬浮于有机相中，可溶性的纳米硒存在于液相中；

步骤9)：收集液相层中的纳米硒，依次用氯仿、乙醇、70％乙醇和无菌水在高速冷冻离心机中于10000±1000rpm离心10±1min，洗涤2～3次；

步骤10)：洗涤后的纳米硒重悬于无菌水中，经冷冻干燥，得到纳米硒微球冻干粉。