[发明专利]ddPCR技术检测IDH1 R132H基因变异的引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种ddPCR技术检测IDH1R132H基因变异的引物、试剂盒及检测方法，检测方法包括提取外周血cfDNA、针对IDH1R132H突变型和野生型设计2个探针和1对引物、以cfDNA为模板进行ddPCR扩增、对获得的扩增产物进行数据分析，获得IDH1R132H突变基因绝对量和比例。基于此方法，本发明还提供了一种检测IDH1R132H基因变异的试剂盒。本发明提供的引物扩增片段为83bp，特别适用于血浆游离DNA等小片段DNA样本的扩增，结合本发明提供的检测探针，可从cfDNA中检测到极低丰度的IDH1R132H基因变异，具有特异性好、灵敏度高的特点，可对人IDH1R132H基因变异进行绝对定量检测，对指导临床治疗、改善患者预后有重要作用。本方法无需采集组织标本，仅使用外周血即可完成检测，特别适合对组织取样不耐受的患者。

技术领域

本发明涉及医学和生物技术领域，尤其涉及一种ddPCR技术检测IDH1 R132H基因变异的引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

脑胶质瘤是最常见的原发性中枢神经系统肿瘤，约占所有颅内原发肿瘤的35％～60％，成人发病率达8～10/10万，5年生存率为20％～30％，近年来其发病率仍有上升的趋势。世界卫生组织(WHO)已确立将脑胶质瘤分类成多种亚型并且将其从I定级到IV(指示其恶性程度)的许多组织学的临床准则。

异柠檬酸脱氢酶(isocitrate dehydrogenase，IDH)是一类在三羧酸循环中起重要作用的酶家族，不仅在能量代谢、氨基酸和维生素合成中扮演重要角色，而且对该酶的活性调节将直接影响IDH或IDH底物参与不同的生物途径、发挥不同的生物功能。哺乳动物细胞中的IDH有以下三种形式：依赖NAD的线粒体IDH1，依赖NADP的线粒体IDH2，依赖NADP的细胞质IDH3。编码依赖NADP的人异柠檬酸脱氢酶1(isocitrate dehydrogenase 1，IDH1)的基因位于染色体2q33.3，其转录mRNA长2339bp，含有10个外显子，编码由414个氨基酸残基组成的异柠檬酸脱氢酶1，主要定位于细胞浆和过氧化物酶体。IDH1作用于一个称为柠檬酸周期的能量生成途径。细胞中的IDH1突变是原发性人体脑瘤主要亚型的共同特点。目前发现的IDH1基因突变都集中在第4外显子的12和13密码子R>H(≥90％)称为R132H，这些突变破坏了IDH1蛋白内在的GTPase活性，从而使得IDH1蛋白处于持续活性状态。美国国家综合癌症网络(NCCN)临床实践指南将有无IDH1/2基因突变作为评估低级别脑胶质瘤患者风险级别的指标之一。

目前脑胶质瘤的诊断方法包括影像学检查、细胞病理学、组织病理学诊断、直接测序法和荧光定量PCR法。影像学检查包括淋巴造影、CT扫描、核磁共振检查等，但是其效率较低并且检测准确度不高；通常的细胞和组织病理学检测包括细胞活检，需要通过外科手术或者穿刺的方法从患者上获取肿瘤组织的检材，但仅靠组织形态学，特别是立体定向取材小标本，使组织缺乏典型病变，常常不能根据肿瘤的密度、异形性、血管增生、坏死等进行分级，不但不方便，而且会对患者造成人体伤害，甚至可能造成穿刺道肿瘤转移；而直接测序法检测突变存在步骤繁琐、成本高、灵敏性差的限制；荧光定量PCR虽然具有重复性好，特异性强等优点，但由于其依赖于Ct值，定量的准确度不够，且灵敏度比较差，目前该方法的灵敏度最好的为1％，无法满足某些高灵敏度的检测需求。