[发明专利]无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测引物组、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测引物组，包括毒力基因sip、fbsA、hylB、cfb、sodA、DltR、cspA、ponA、bibA、srr‑1、bca、iagA、scpB、fbsB、pavA、psaA、spb1、bac、cppA、lmb和cylE对应的PCR扩增引物对。各引物序列如序列表所示。本发明还公开了包含上述引物组的试剂盒以及应用上述引物组的无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测方法。所述检测方法以sip、fbsA、hylB、cfb、sodA、DltR和cspA为第一组，ponA、bibA、srr‑1、bca、iagA、scpB和fbsB为第二组，pavA、psaA、spb1、bac、cppA、lmb和cylE为第三组，同时在同一反应条件下进行PCR反应，同时扩增21个毒力基因目的片段的靶序列，可根据检测结果确定样品是否为无乳链球菌，确定无乳链球菌宿主来源以及分型，评价菌株毒力基因谱型的变异。

技术领域

本发明涉及无乳链球菌的检测，具体涉及无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR 检测引物组、试剂盒及检测方法。

背景技术

无乳链球菌(Streptococcus agalactiae)隶属于芽孢杆菌纲，乳杆菌目，链球菌科，链球菌属，也称B簇链球菌(group B streptococci，GBS)，为革兰氏阳性球菌，是引起新生儿脑膜炎、败血症、肺炎及奶牛乳腺炎等的重要病原菌，能感染多种水生动物，是重要的人兽鱼共患病原菌。目前，发现有80多种养殖鱼类容易受到无乳链球菌的感染，世界水产业每年因无乳链球菌病造成的损失高达100亿美元。

人源无乳链球菌的分子血清型和ST型都十分丰富，但鱼源的分子血清型和ST 型相对比较单一，因此，可考虑用毒力基因对鱼源无乳链球菌进行分型。目前，鱼源无乳链球菌毒力基因分型的方法主要是根据检出相关基因的阳性或阴性结果来确定毒力基因谱。研究显示，鱼源无乳链球菌Ia型和Ib型有3个毒力基因(bac、bca和 cylE)存在差异，而Ⅲ型无乳链球菌无bac基因但含有bca基因，Ib-ST-260/261均无bac和bca基因。通过检测毒力基因发现，鱼源无乳链球菌均缺失PI-2a基因，但含有PI-1+PI-2b。在中国，2011年之前PI-2b型鱼源无乳链球菌为主要流行株，而 PI-1+PI-2b型则是近几年流行株，与国外的研究结果存在差异。此外，与其他无乳链球菌基因组比较发现，鱼源无乳链球菌菌株中缺失scpB和lmb基因序列。目前，对无乳链球菌毒力基因检测涉及较少，如仅利用单一、双重和三重PCR的方法检测sip、 cpsE、hylB、ponA和cfb等毒力基因，这些方法只是为了单纯的检测某些基因的有或无，不能确定无乳链球菌的宿主来源、分型及毒力基因谱型变异情况。有鉴于此，开发一种快速、高效、灵敏度高的无乳链球菌毒力基因三连七重PCR势在必行，这对于确定该无乳链球菌的宿主来源、分型，全面展现无乳链球菌毒力基因谱、致病性、分子流行及遗传变异等方面具有重要的意义。

发明内容

本发明目的之一在于提供一种无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测引物组。

本发明目的之二在于提供无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测试剂盒。

本发明目的之三在于提供无乳链球菌毒力基因的三连七重PCR检测方法。

本发明目的之四涉及所述检测引物组的应用。