[发明专利]一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法有效
申请号: | 201810421118.X | 申请日: | 2018-05-04 |
公开(公告)号: | CN108715881B | 公开(公告)日: | 2020-11-10 |
发明(设计)人: | 郑仁朝;郑裕国;张琴;汤晓玲;卢夏锋 | 申请(专利权)人: | 浙江工业大学 |
主分类号: | C12P41/00 | 分类号: | C12P41/00;C12P13/00 |
代理公司: | 杭州天勤知识产权代理有限公司 33224 | 代理人: | 胡红娟 |
地址: | 310014 浙*** | 国省代码: | 浙江;33 |
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摘要: | |||
搜索关键词: | 一种 区域 立体 选择性 生物 催化 合成 巴林 手性 中间体 方法 | ||
1.一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,包括:
外消旋异丁基丁二腈在反应介质中,腈水解酶和酰胺酶催化下,20~50℃温度下,反应4~10h,得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸;
所述的腈水解酶为芜菁腈水解酶BrNIT、BrNIT2、拟南芥腈水解酶AtNIT或高山南芥腈水解酶AaNIT;
所述的酰胺酶为Pa-Ami或Dt-Ami。
2.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述外消旋异丁基丁二腈的浓度为10~150g/L。
3.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述腈水解酶由含腈水解酶的湿菌体细胞提供,所述酰胺酶由含酰胺酶的湿菌体细胞提供;所述含腈水解酶与酰胺酶的湿菌体细胞的质量比为1~12:1。
4.根据权利要求3所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述含酰胺酶的湿菌体细胞与外消旋异丁基丁二腈的质量比为0.05~0.15:1。
5.根据权利要求3所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞的制备方法,包括:
(1)设计含酶切位点XhoI和XbaI的腈水解酶基因序列,克隆至空载体pET28b,获得重组质粒,回收后转化至大肠杆菌,培养检测阳性菌,得到腈水解酶基因工程菌;或,
设计含有EcoRI和NcoI位点的酰胺酶基因序列,克隆至空载体pET28b,构建表达载体,热击转化到大肠杆菌,培养检测阳性菌,得到酰胺酶基因工程菌;
(2)将腈水解酶基因工程菌/酰胺酶基因工程菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中,25~37℃,100~200rpm,培养6~8h后,得菌体种子液;
将上述菌体种子液以2%的体积比转接至新鲜的含卡那霉素的LB液体培养基中,25~37℃,100~200rpm,培养至菌体OD600为0.6~0.8时,加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷,25~30℃、100~150rpm发酵10~12h,收集发酵液于0~5℃,6000~9000rpm的条件下离心10~15min,生理盐水洗涤菌体后,得到含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞;
所述卡那霉素的浓度为30~60mg/L;
所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.05~0.2mM。
6.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的反应介质由纯水或缓冲体系组成。
7.根据权利要求6所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法,其特征在于,所述的缓冲体系为磷酸钠缓冲液体系、Tris-HCl缓冲液体系或Gly-NaOH缓冲液体系,所述缓冲液体系的pH范围为6.0~11.0。
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