[发明专利]一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法

权利要求书

1.一种区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，包括：

外消旋异丁基丁二腈在反应介质中，腈水解酶和酰胺酶催化下，20～50℃温度下，反应4～10h，得到(S)-3-氰基-5-甲基己酸；

所述的腈水解酶为芜菁腈水解酶BrNIT、BrNIT2、拟南芥腈水解酶AtNIT或高山南芥腈水解酶AaNIT；

所述的酰胺酶为Pa-Ami或Dt-Ami。

2.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述外消旋异丁基丁二腈的浓度为10～150g/L。

3.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述腈水解酶由含腈水解酶的湿菌体细胞提供，所述酰胺酶由含酰胺酶的湿菌体细胞提供；所述含腈水解酶与酰胺酶的湿菌体细胞的质量比为1～12:1。

4.根据权利要求3所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述含酰胺酶的湿菌体细胞与外消旋异丁基丁二腈的质量比为0.05～0.15:1。

5.根据权利要求3所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述的含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞的制备方法，包括：

(1)设计含酶切位点XhoI和XbaI的腈水解酶基因序列，克隆至空载体pET28b，获得重组质粒，回收后转化至大肠杆菌，培养检测阳性菌，得到腈水解酶基因工程菌；或，

设计含有EcoRI和NcoI位点的酰胺酶基因序列，克隆至空载体pET28b，构建表达载体，热击转化到大肠杆菌，培养检测阳性菌，得到酰胺酶基因工程菌；

(2)将腈水解酶基因工程菌/酰胺酶基因工程菌落接入含有卡那霉素的LB液体培养基中，25～37℃，100～200rpm，培养6～8h后，得菌体种子液；

将上述菌体种子液以2％的体积比转接至新鲜的含卡那霉素的LB液体培养基中，25～37℃，100～200rpm，培养至菌体OD₆₀₀为0.6～0.8时，加入异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷，25～30℃、100～150rpm发酵10～12h，收集发酵液于0～5℃，6000～9000rpm的条件下离心10～15min，生理盐水洗涤菌体后，得到含腈水解酶的湿菌体细胞/含酰胺酶的湿菌体细胞；

所述卡那霉素的浓度为30～60mg/L；

所述异丙基-β-D-硫代吡喃半乳糖苷的浓度为0.05～0.2mM。

6.根据权利要求1所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述的反应介质由纯水或缓冲体系组成。

7.根据权利要求6所述的区域、立体选择性生物催化合成普瑞巴林手性中间体的方法，其特征在于，所述的缓冲体系为磷酸钠缓冲液体系、Tris-HCl缓冲液体系或Gly-NaOH缓冲液体系，所述缓冲液体系的pH范围为6.0～11.0。