[发明专利]一种R-Loop高通量测序文库构建方法在审
| 申请号： | 201810423700.X | 申请日： | 2018-05-06 |
| 公开（公告）号： | CN108588200A | 公开（公告）日： | 2018-09-28 |
| 发明（设计）人： | 沈欢;唐琼;陆利;秦闯华;鞠魏;唐薇;朱虎;徐根明;潘艺;赵谦 | 申请（专利权）人： | 湖南大地同年生物科技有限公司 |
| 主分类号： | C12Q1/6869 | 分类号： | C12Q1/6869;C12Q1/6806;C12N15/10;C40B50/06 |
| 代理公司： | 暂无信息 | 代理人： | 暂无信息 |
| 地址： | 410205 湖南省长*** | 国省代码： | 湖南;43 |
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| 摘要： | |||
| 搜索关键词： | 测序文库 高通量 构建 杂合 高通量测序技术 生物技术领域 免疫共沉淀 文库构建 单链DNA 基因组 富集 建库 捕获 灵敏 | ||
1.一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于按照以下步骤进行：
(1)提取基因组DNA对其进行片段化处理；
(2)在步骤(1)后加入磁珠进行片段化产物纯化；
(3)在步骤(2)后加入捕获磁珠，特异性捕获DNA-RNA杂合链；
(4)在步骤(3)后加入磁珠进行捕获产物纯化；
(5)在步骤(4)后加入酶1反应体系，进行末端修复；
(6)在步骤(5)后加入酶2反应体系，进行接头连接反应；
(7)在步骤(6)后加入磁珠进行接头连接产物纯化；
(8)在步骤(7)后加入PCR扩增体系，进行文库的放大；
(9)在步骤(8)后加入磁珠对扩增后的文库进行纯化，纯化后的产物即为上机文库。
2.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的片段化采用物理法或酶法，提取的基因组DNA含量至少为50ng，将基因组DNA打断成200-500bp。
3.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的捕获磁珠包含三个部分，分别是[S9.6]Antibody，Protein A和特异性修饰的磁珠，其中磁珠表面特异性修饰的基团可以和Protein A紧密结合。
4.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的酶1体系包含T4 PNK，T4 DNA Polymerase，dNTP和T4 DNA ligase Buffer，末端修复条件是37℃，30min后72℃，20min。
5.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的酶2反应体系包含T4 DNA ligase，T4 DNA ligase Buffer，PEG6000和RNA Adapter，接头连接反应条件是20℃，15min；65℃，10min；所述接头包括Universal Adapter和RNA Adapter，其中Universal Adapter即为P5端接头，包括P5结合序列和Read1阅读序列，RNA Adapter即为P7端接头，包括P7结合序列，Index序列和Read2阅读序列。
6.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的扩增体系包含缓冲液，DNA聚合酶，dNTPs以及一对上下游引物，上游引物P5，是文库P5端接头特异性引物序列，下游引物P7，是文库P7端接头特异性引物序列。
7.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的文库大小为400-500bp。
8.根据权利要求1所述的一种R-Loop高通量测序文库构建方法，其特征在于所述的上机文库适用于Roche、Illumina、ThermoFisher、Pacific Biosciences、华大基因、OxfordNanopore Technologies、华因康、瀚海基因高通量测序平台。
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