[发明专利]一种牛冠状病毒ELISA检测试剂盒

说明书

本发明公开了一种牛冠状病毒ELISA检测试剂盒，将应用纯化的BCoV‑CD分离株重组pET‑32a‑N蛋白作为包被抗原，优化反应条件，建立检测牛血清特性N蛋白抗体的间接ELISA诊断方法，采用大肠杆菌原核表达，不仅原料来源广泛，易于制备，易于标准化，生产检测过程更安全、可靠，适宜基层单位推广使用。

技术领域

本发明涉及病毒检测技术领域，尤其涉及一种牛冠状病毒ELISA检测试剂盒。

背景技术

腹泻是新生犊牛最严重的疾病之一，犊牛在生命的第一个月内发生腹泻的风险最大，腹泻发生率随年龄的增长而下降，犊牛腹泻主要与隐孢子虫、牛轮状病毒、牛冠状病毒和肠毒素性大肠杆菌(K99)等四种主要肠道病原体有关。牛冠状病毒是导致成年牛冬痢(WD)和犊牛冠状病毒性腹泻(CD)最主要的病原，BCoV在牛群中广泛传播，该病在世界各国均有流行。通过动物血清中抗体检测调查，发现牛冠状病毒在东北三省存在很高的阳性率。

一般来说，对于牛冠状病毒的检测方法有很多，包括一般方法有EM、IEM、IF、IFA、HA、RT-PCR、RTFQ PCR、ELISA等很多方法，虽然前几种方法可以准确的对BCoV进行诊断，但是这几种方法诊断周期较长，诊断费用较高，不能用于进行大规模的牛场的快速诊断，在疾病大规模爆发之际，精确的诊断效果和缩短诊断时间才能更好的减少牛场的经济损失。因此，ELISA方法可以对牛场进行大批量的检测，而且检测结果较为准确。

本发明采用纯化的BCoV-N蛋白作为抗原进行ELISA方法建立，因为N基因变异程度更小，其羧基端更加保守，可以作为牛冠状病毒的诊断抗原，具有很强的免疫原性，可以更好的用于早期诊断。

发明内容

基于背景技术存在的技术问题，本发明提出了一种牛冠状病毒ELISA检测试剂盒。

本发明的技术方案如下：

一种牛冠状病毒ELISA检测试剂盒，所述的试剂盒中含有重组的N蛋白。

优选的，所述的重组的N蛋白为BCoV-CD分离株重组pET-32a-N蛋白。

优选的，所述的重组的N蛋白是经DNAStar软件预测的N蛋白免疫原性较好的疏水区域。

优选的，所述的重组的N蛋白的制备方法，包括以下步骤：

A、引物设计与合成:根据GenBank上发布的BCoV-Mebus分离毒株，使用Premier5.0软件设计N基因引物序列，同时在引物序列上插入SalⅠ和BamHⅠ酶切位点，便于原核表达；

B、重组克隆质粒构建；

C、重组表达载体构建:鉴定正确的阳性BCoV-CD-N-T蛋白基因重组菌进行抽提质粒；将BCoV-CD-N-T质粒与表达载体pET-32a(+)质粒分别用BamH I、Sal I进行双酶切；

D、重组质粒在大肠杆菌BL21中表达；

表达蛋白的提取；重组蛋白SDS-PAGE电泳；染色和脱色；

E、重组蛋白的Western blot鉴定；

F、重组蛋白可溶性分析；

G、重组N蛋白的纯化；

H、重组蛋白浓度测定。

本发明的有益之处在于：

本研究方法与已发表文献相比较的优点：(文献《牛冠状病毒重组N蛋白间接ELISA检测方法的建立》)

1.本研究克隆表达的是经DNAStar软件预测的N蛋白免疫原性较好的疏水区域，同时具有高度的保守性。(文献采用的是BCoV的完整的N蛋白)