[发明专利]寡糖的大规模酶合成的方法

权利要求书

1.一种以酶性方式合成寡糖的方法，其特征在于，包含：

(i)包括在UDP-GalNAc再生酶组存在下，自GalNAc生成UDP-GalNAc，其中该UDP-GalNAc再生酶组包含N-乙酰己糖胺1-激酶、N-乙酰己糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶、丙酮酸激酶；

(ii)在UDP-GalNAc及β-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶存在下，将Globo三糖-OR^1A(Gb3-OR^1A)转换为Globo四糖-OR^1A(Gb4-OR^1A)，其中R^1A为氢、经取代或未经取代的烷基、经取代或未经取代的烯基、经取代或未经取代的炔基、经取代或未经取代的环碳基、经取代或未经取代的杂环基、经取代或未经取代的芳基、经取代或未经取代的杂芳基或氧保护基团、生物素或神经酰胺；

(iii)在UDP-Gal及β-1,3-半乳糖转移酶存在下，将Gb4-OR^1A转换为Globo五糖-OR^1A(Gb5-OR^1A)；及

(iv)在UDP-Gal再生酶组存在下，自半乳糖生成UDP-Gal，其中该UDP-Gal再生酶组包含半乳糖激酶、UDP-糖焦磷酸化酶、丙酮酸激酶。

2.如权利要求1所述的方法，其特征在于，UDP-GalNAc再生酶组还包含：焦磷酸化酶。

3.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(i)及(ii)可在Gb4-合成反应混合物中进行，其中该反应混合物包含GalNAc、PEP、ATP、UTP、Gb3-OR^1A、β-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶及UDP-GalNAc再生酶组。

4.如权利要求2所述的方法，其特征在于，该β-1,3-N-乙酰半乳糖胺转移酶是来自流感嗜血杆菌的LgtD，该N-乙酰己糖胺1-激酶是来自龙根菌、该N-乙酰己糖胺1-磷酸尿苷酰转移酶是来自大肠杆菌，该丙酮酸激酶是来自大肠杆菌,或该焦磷酸化酶是来自大肠杆菌。

5.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含分离Gb4-OR^1A。

6.如权利要求1所述的方法，其特征在于，UDP-Gal再生酶组还包含焦磷酸化酶。

7.如权利要求1所述的方法，其特征在于，(iii)及(iv)可在Gb5-合成反应混合物中进行，其中该反应混合物包含半乳糖、PEP、ATP、UTP、Gb4-OR^1A、β-1,3-半乳糖转移酶及UDP-Gal再生酶组。

8.如权利要求6所述的方法，其特征在于，该β-1,3-半乳糖转移酶是来自流感嗜血杆菌的LgtD，该半乳糖激酶是来自大肠杆菌，该UDP-糖焦磷酸化酶是来自拟南芥，该丙酮酸激酶是来自大肠杆菌,或该焦磷酸化酶是来自大肠杆菌。

9.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含分离Gb5-OR^1A。

10.如权利要求1所述的方法，其特征在于，进一步包含：

(v)在GDP-Fuc及α-1,2-岩藻糖转移酶存在下，将Gb5-OR^1A转换为岩藻糖-Gb5-OR^1A。

11.如权利要求10所述的方法，其特征在于，进一步包含：

(vi)在GDP-Fuc再生酶组存在下，自岩藻糖生成GDP-Fuc，其中该GDP-Fuc再生酶组包含L-岩藻糖激酶/GDP-岩藻糖焦磷酸化酶、丙酮酸激酶。

12.如权利要求11所述的方法，其特征在于，GDP-Fuc再生酶组还包含焦磷酸化酶。