[发明专利]高效快速获取植物RNA病毒末端序列的RACE方法

说明书

本发明公开了一种高效快速获取植物RNA病毒末端序列的RACE方法，步骤：1)感染目标病毒的植物的总RNA抽提；2)对提取的总RNA加Poly(A)尾；3)对加Poly(A)尾的RNA进行提纯；4)一步法RT‑PCR：将加Poly(A)尾提纯后的总核酸作为模板，上游通用引物为M4Tm，设计目标病毒的特异性下游引物GSP1，利用引物M4Tm和GSP1进行扩增；对RT‑PCR的扩增产物进行纯化、连接、转化和克隆验证。本发明直接在正负义链的3’序列末端加上Poly(A)尾巴，通过常规一步法RT‑PCR或者进一步的巢式PCR即可获得末端序列，5’和3’末端无区别操作，步骤简单。

技术领域

本发明属于分子生物学领域，具体涉及一种高效快速获取植物RNA病毒末端序列的RACE方法。

背景技术

RACE(rapid amplificationofcDNAends)技术是一种通过PCR克隆cDNA序列末端的方法，cDNA全长序列对基因结构、蛋白质表达和基因功能的研究至关重要。目前，市场上流通的商品化RACE试剂盒有以下缺点：1)对核酸纯度要求高，一般需用TRIzol法甚至核酸抽提试剂盒才能达到要求；2)受RNA结构影响，需进行去磷酸化或去帽前处理，步骤较繁琐；3)实验需要多次纯化操作，大大降低了核酸的浓度和质量；4)对特异性引物要求较高，特异性目的条带不易获得；5)成本高。

RACE试剂盒高成本、程序复杂、低成效率的特点使国内大多数实验室对RACE技术望而却步，心有余而力不足，从而延缓了我国科学研究中RNA完整序列的获得。

发明内容

本发明的目的在于针对上述技术问题，提供一种低成本、程序简单、特异性高的高效快速获取植物RNA病毒末端序列的RACE方法。

本发明实现其目的的技术方案为：

一种高效快速获取植物RNA病毒末端序列的RACE方法，包括如下步骤：

1)感染目标病毒的植物的总RNA抽提；

2)对提取的总RNA加Poly(A)尾；

3)对加Poly(A)尾的RNA进行提纯；

4)一步法RT-PCR：将加Poly(A)尾提纯后的总核酸作为模板，上游通用引物为M4Tm，使用软件设计目标病毒的特异性下游引物GSP1，利用引物M4Tm和GSP1进行扩增，M4Tm序列如SEQ ID NO:33所示；对RT-PCR的扩增产物进行纯化、连接、转化和克隆验证。

在上述技术方案中，还包括步骤5)巢式PCR：设计目标病毒巢式PCR下游引物GSP2，以步骤4)一步法RT-PCR PCR产物为模板，利用引物M4Tm和GSP2进行巢式PCR，将目的条带纯化并进行连接、转化和克隆验证。当步骤4)扩增不出特异条带时就继续进行步骤5)。

所述步骤2)对提取的总RNA加Poly(A)尾的反应体系为：10mMATP 4μl，PolyAPolymerse 2μl，总RNA 5μg，10×PolyAReaction Buffe 4μl，RNase-free ddH₂O补齐到40μl；37℃反应30min。

所述步骤4)中的PCR反应程序为：55℃30min；94℃3min；94℃30s，X1℃45s，72℃Y1s，35个循环；72℃7min；其中，退火温度X1由引物GSP1的Tm值决定，延伸时间Y1由扩增片段的长度决定，1kb/min。

所述步骤5)中的PCR反应程序为：95℃3min；95℃30s，X2℃45s，72℃Y2min，30个循环；72℃10min；其中退火温度X2由引物GSP2的Tm值决定，延伸时间Y2由扩增片段的长度决定，1kb/min。

在上述技术方案中，采用步骤1)至4)进行RACE方法的植物RNA病毒为柑橘衰退病毒或者柑橘囊胶病毒。