[发明专利]CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用

说明书

本发明公开了CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用，所述基因敲除猪为敲除了GGTA1基因、CMAH基因和β4GalNT2基因的猪，所述CRISPR/Cas9载体组合包括GGTA1‑CRISPR/Cas9载体、CMAH‑CRISPR/Cas9载体和β4GalNT2‑CRISPR/Cas9载体。通过设计特异性靶向的SgRNA序列，三个基因敲除效率分别为56％、63％和41％，敲除与免疫排斥反应有关的三个基因，得到三基因敲除猪，其红细胞与人血清中免疫球蛋白结合显著降低，对克服超急性免疫排斥反应有显著作用，有效解决了临床缺血的问题，为临床输血提供宝贵的材料来源。

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用。

背景技术

现代医学不断进步，输血在临床上被大量使用，但同样面临越来越多的问题，包括艾滋病、乙肝、丙肝等高发的传染病导致严重的输血风险。血液需求不断增多而献血量相对减少，血源资源日渐紧张。从19世纪至今，异种输血研究致力于用动物红细胞(RBCs)研发出人RBCs输血的替代品。在事故或战况下急性失血时，异种输血后能维持2-3天的生理功能，延长治疗的时间窗；病人对人RBCs敏感需要持续输血情况下，异种输血可以延长寿命和RBCs的功能。目前已有大量异种输血研究，用α-半乳糖苷酶和甲氧基聚乙二醇等方法修饰Gal抗原，或用基因敲除Gal和non-Gal抗原等方法修饰动物RBCs，为异种输血提供可能。猪红细胞(pRBCs)已广泛用于异种输血红细胞的研发。pRBCs异种输血有一定的优势，pRBCs和人RBCs具有大量的相似性。尽管pRBCs寿命比人的RBCs短，但是他们的直径和数量是相似的。猪的血型系统A-O(H)跟人的ABO血型系统是相关的。猪血红蛋白与人类血红蛋白具有85％的序列相同和相似的三维结构。同时，饲养在无特定病原体和生物安全条件下，pRBCs不携带人类的病原微生物，pRBCs不表达MHC抗原，即猪白细胞抗原(SLA)，因此降低了免疫原性。pRBCs没有细胞核，不可能携带猪内源性逆转录病毒。

但是pRBCs用于临床输血还有许多免疫学问题。将野生型pRBCs输注到灵长类动物体中会产生抗体-抗原结合，补体激活，以及输血细胞的直接裂解。因为野生型pRBCs表达了人类具有天然溶血抗体的Gal和non-Gal抗原。Gal是由α1,3-galactosyltransferase(GGTA1)产生的一种末端低聚糖，类似于A、B和O糖类，是灵长类天然抗体的主要目标抗原，当猪器官或细胞移植到非人灵长类时，产生一致的超急性排斥反应。目前还发现了一些引起急性排斥反应的抗non-Gal天然抗体，尽管与抗Gal抗体相比，抗non-Gal抗体相关的细胞毒性显著降低。其中一些抗原在pRBCs上表达，如N-glycolylneuraminic acid(NeuGc)和b1,4N-acetylgalactosaminyltransferase(B4GalNT2)。B4GalNT2是产生Sd^a血型抗原的一种糖基转移酶。NeuGc是一种糖偶联唾液酸，存在于人以外的所有哺乳动物体内，几乎100％的人类身上都可以检测到抗NeuGc抗体。因此，如果pRBCs能成功地为人类输血，那么α-1,3-半乳糖基转移酶(GGTA1)，CMP-N-乙酰神经氨酸羟化酶(CMAH)和β-1,4-N-乙酰氨基半乳糖转移酶2(β4GalNT2)抗原就需要从pRBCs膜上消失。

发明内容

发明目的：为了解决现有异种红细胞临床输血中存在的免疫排斥反应，本发明提供了一种CRISPR/Cas9载体组合在制备基因敲除猪的血液制品中的应用。