[发明专利]一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明公开了一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物。本发明还公开了一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法。本发明提供的引物、试剂盒及检测方法在检测洪湖碘泡虫上灵敏度高、特异性强、重复性好、快速简便，最低可检测302个拷贝，不仅能从感染鱼的组织中检测出洪湖碘泡虫，也能从周年发病池塘的水样、泥样等环境样品中检测出洪湖碘泡虫，实现对养殖环境中的洪湖碘泡虫全生活史发育阶段时空动态的定量监测。本发明提供的引物、试剂盒及检测方法为鲫“喉孢子虫病”的早期快速诊断、监测、流行病学调查、苗种的产地检疫、“喉孢子虫病”发生的风险评估与预警、药效的评价及制定合理防控对策均可提供技术支撑。

技术领域

本发明涉及鱼类寄生虫检测领域，具体涉及一种洪湖碘泡虫的实时荧光定量PCR检测引物、检测试剂盒及检测方法。

背景技术

粘体动物(Myxozoa)是一类主要寄生于鱼类、少部分寄生于两栖类、爬行类、鸟类和哺乳类的后生动物寄生虫。据文献资料记载，寄生于异育银鲫的粘孢子虫种类超过40种，能导致病害的有10多种。异育银鲫是中国科学院水生生物研究所的鱼类育种专家于1976～1981年研制成功的一种鲫鱼养殖新对象它是利用天然雌核发育的方正银鲫为母本，以兴国红鲤为父本，经人工授精繁育的子代。因其具有生长快、易饲养、抗逆性强肉质鲜美等优点，是我国重要的鲫鱼养殖品种。近年来，伴随着大规模集约化养殖的发展，异育银鲫粘孢子虫病害也日趋严重，不仅影响异育银鲫苗种培育，还危害成鱼养殖，给异育银鲫养殖业带来较大创伤。

粘孢子虫具有复杂的生活史，其宿主包括鱼和底栖无脊椎动物，如水蚯蚓。研究表明，粘孢子虫生活史主要分为两个阶段(1)无性生殖阶段：粘孢子虫在宿主鱼体内无性生殖形成营养体，然后通过血液移行到靶器官发育成熟形成成熟孢子，孢子成熟后脱落或随着鱼体死亡、鱼体粪便、尿液排入水中沉到水底被底泥中水蚯蚓吞食(2)有性生殖阶段：成熟孢子在水蚯蚓体内行有性生殖发育、移行、并以放射孢子虫的形式释放到水中，水中的放射孢子虫又通过皮肤、鳃等器官感染宿主鱼并在体内发育成熟进入下一个生活史。

洪湖碘泡虫(Myxobolus honghuensis)是危害鲫的重要病原体，也是危害异育银鲫最为严重的粘孢子虫。因其主要感染异育银鲫的咽喉部，俗称“喉孢子虫”。感染早期，鱼体无明显症状，随着感染程度加深，洪湖碘泡虫在鱼体咽部形成肉眼可见的孢囊，甚至取代整个咽部。目前我国对“喉孢子虫病”尚无有效的预防和治疗措施，主要原因是当今对该病的诊断以肉眼可见孢囊为标准，而孢囊形成后已是发病末期，药物难以进入几丁质的壳瓣，无法起到杀死虫子的效果。但当孢子虫在鱼体内处于营养体以及在水中处于放射孢子虫阶段往往是药物敏感期，从而达到预防的目的。因此，发展一种洪湖碘泡虫的早期检测方法检测鱼体内处于营养期的孢子、水体中的放射孢子和底泥中的孢子丰度尤为重要，以期为洪湖碘泡虫的早期诊断和病害防控奠定理论基础。

目前关于洪湖碘泡虫的检测方法，主要有形态学方法、免疫学方法和聚合酶链式反应(PCR)分子生物学方法。形态学方法通过常规肉眼观察、光学显微镜或电镜检查成熟孢子；免疫学方法利用制备的抗体对粘孢子虫病原体进行检测；分子生物学方法根据粘孢子虫核糖体基因(rDNA)序列设计特异性引物，并对待测DNA模板进行PCR扩增，测序分析扩增片段，再与相应的基因序列进行比对，得出检测结果。虽然这些方法都能达到检测的目的，但仍有一些不足，比如，漏诊率高，易出现假阳性，操作繁琐，易污染，敏感性相对较低，耗时长等，最重要是无法对病原丰度进行定量。

实时荧光定量PCR技术(rea1-time fluorescent quantitative PCR，Q-PCR)是一种在PCR定性技术基础上发展起来的核酸定量技术，通过在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号积累实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。目前已广泛应用于分子生物学研究，医学研究，临床疾病诊断，动物疾病检测等领域中，具有特异性强、重复性好、敏感性高、操作简便、耗时短和无污染等优点，已成为目前核酸定量检测的首选方法。