[发明专利]BRAF V600E基因突变检测引物、方法及试剂盒

说明书

本发明公开了BRAF V600E基因突变检测引物、方法及试剂盒，该试剂盒含有SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2所述的引物、还含有检测探针。本发明采用更优的引物和探针，对样本gDNA仅需10ng，灵敏度高达0.1％，特异性高，根据突变扩增曲线直接判断有无突变，无需计算ΔCt，结果判读简单直接，具有很好的临床应用前景。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及BRAF V600E基因突变检测引物、方法及试剂盒。

背景技术

BRAF是人类最重要的原癌基因之一，位于7q34，长约190kb，编码783个氨基酸。BRAF基因突变发生于黑色素瘤、结肠癌、甲状腺癌、肺癌、肝癌和胰腺癌等恶性肿瘤中，且绝大部分突变为BRAF V600E(c.1799TA)突变。该突变导致下游MEK-ERK信号通路持续激活，对肿瘤的生长增殖和侵袭转移至关重要。2011年，首个BRAF V600E靶向抑制剂维罗非尼被FDA批准上市，用于治疗BRAF V600E突变的晚期黑色素瘤患者，有效延长了患者无进展生存期及总生存期，取得了突破性的治疗效果。

《NCCN甲状腺癌临床实践指南2016版》中，明确提出对细针穿刺活检结果出现不能判断的应对BRAF基因突变状态进行检测，有助于病理分型诊断和临床预后预测及制定个体化治疗方案。

《NCCN结直肠癌临床实践指南》(2016版)中要求在使用西妥昔单抗(Erbitux/Cetuximab)或帕尼单抗(Vectibix/Panitumumab)抗EGFR的一线治疗靶向药物时，应检测BRAF基因突变情况，如发生V600E突变，使用靶向药物的疗效较差或可能无效。BRAF V600E检测对于指导靶向药物的使用有重要意义。

qPCR检测基因点突变最常用的方法是突变扩增系统(amplification refractorymutation system,ARMS)PCR。Arms-PCR是一种用来检测已知突变的方法。其基本原理是如果引物3’末端碱基不与模板完全匹配，引物延伸就会受阻。根据已知点突变设计引物，引物3’端碱基与突变型模板碱基互补，PCR只扩增突变型模板，从而达到检测点突变的目的。

目前临床上肿瘤患者穿刺组织经常出现组织肿瘤细胞过少或穿刺组织样本基因组量少的情况，而对此类样本点突变的检测则要求更高灵敏度的技术。一方面能检测低肿瘤细胞比例(小于20％)的样本，降低假阴性风险；另一方面检测所需组织样本基因组更少。

然而现在市面上针对BRAF V600E突变检测的Arms-PCR产品灵敏度约为5％，且不能完全抑制野生型样本的扩增，结果判读需计算ΔCt较复杂，不能满足临床要求。

发明内容

本发明的目的在于提供BRAF V600E基因突变检测引物和试剂盒。

本发明的另一目的在于提供BRAF V600E基因突变检测方法。

本发明所采取的技术方案是：

BRAF V600E基因突变检测引物，引物的核苷酸序列如下所示：

F1：5'-GGTGATTTTGGTCTAGCTACCGA-3'(SEQ ID NO:1)；

R1：5'-CCATCCACAAAATGGATCCAGAC-3'(SEQ ID NO:2)。

一种BRAF V600E基因突变检测试剂盒，该试剂盒含有上述所述的引物。

进一步的，该试剂盒还含有检测探针，其核苷酸序列如下所示：

P1：5'-TGGAGTGGGTCCCATCA-3'(SEQ ID NO:3)，或者为该序列的核苷酸反向互补序列。