[发明专利]一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法

说明书

本发明公开了一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法。冻干微球包括冻干保护剂、缓冲液、酶反应液和特异性核酸扩增反应试剂。冻干微球的制备方法包括以下步骤：核酸扩增反应体系与冻干保护剂混合均匀后，滴入液氮中冷冻成微球，然后将微球在真空冷冻干燥机中冷冻干燥。冻干试剂微球生物活性较好，操作简单，便于常温保存和运输。冻干微球用于实时荧光定量PCR、普通PCR，与全自动核酸检测仪配套使用，利于现场化快速检测。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法。

背景技术

聚合酶链式反应（Polymerase Chain Reaction, PCR）是一种体外扩增特定核酸序列的分子生物学技术。核酸扩增技术包括常规PCR、实时荧光定量PCR、等温核酸扩增技术等。常规PCR是基于DNA或者RNA的PCR技术，被广泛用于基因克隆和鉴定，疾病诊断和基因突变检测。实时荧光定量PCR是指在PCR反应体系中，加入荧光染料或者荧光标记的探针，通过荧光信号的累积实时检测PCR反应进程，利用标准曲线对未知模板进行定量分析。实时荧光定量PCR技术具有灵敏度高、特异性强、反应快速等特点，被用于临床疾病诊断、动物微生物疾病检测、食品安全等方面。

PCR反应检测结果的准确性决定于核酸扩增试剂的活性及正确使用。核酸扩增试剂包括各种酶、缓冲液，盐离子、镁离子、寡核苷酸等，进行PCR反应时需要混合所有成分。单个反应体系的多种成分是痕量，操作时会导致一定的实验误差，无法保证实验结果的重复性。在实验过程中，痕量试剂的使用比较容易出现外源性污染。

核酸扩增试剂尤其是酶制剂受温度的影响较大，一般需要低温（-20℃）或者4℃保存，需要干冰运输，且反复冻融会降低酶的活性。在现场化应急性快速检测应用时，常规的冷冻保存实验试剂难以满足实用需求，必须实现对温度敏感的酶试剂进行常温保存。

冻干保护剂具有填充、赋形、稳定的作用，在冷冻和干燥过程中，保护核酸扩增试剂的结构，保持其生物活性。真空冷冻干燥技术可将试剂溶液在较低的温度下冻结成固态，在真空条件下使其中的固态水升华为气态，待升华结束后再进行解吸干燥，除去部分结合水。低温条件下干燥可减少热敏性酶试剂的降解失活，冷冻干燥试剂微球（Bead）具有较好的形态和最佳的含水量，操作简便，在常温长期保存下具有生物活性，适合常温运输。核酸扩增试剂冻干微球可应用于临床床边体外诊断、突发传染病的应急处理、检验检疫现场化快速检测等。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是核酸扩增反应试剂的常温保存，提供一种核酸扩增反应试剂的冻干微球及其制备方法。

为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案为：

一种核酸扩增反应试剂的冻干微球，其包括：冻干保护剂、缓冲液、酶反应液和特异性核酸扩增反应试剂。

所述的冻干保护剂包括海藻糖、甘露醇、右旋糖酐、牛血清白蛋白、表面活性剂、消泡剂。海藻糖的浓度为2~30%；甘露醇的浓度为1~20%；右旋糖苷为Dextran 10，Dextran 40或Dextran 70，浓度为0.4~10%； 牛血清白蛋白的浓度为0.1~5mg/ml；表面活性剂为Tween20，Tween80或者Triton X-100，浓度为0.2~5%；消泡剂的浓度为0.03~1.2%。

所述的缓冲液包括以下一种或者几种成分：Tris-HCl缓冲液、HEPES缓冲液、氯化钾、氯化镁、甘氨酸、硫酸铵、氯化铵、硫酸镁、脱氧核糖核酸三磷酸。

所述的酶反应液包括以下一种或者几种试剂：DNA聚合酶、尿嘧啶-N-糖基化酶、RNA逆转录酶、RNA聚合酶、RNA酶抑制剂、ATP硫酸化酶、单链结合蛋白、无机焦磷酸酶、三磷酸腺苷双磷酸酶、拓扑异构酶、解旋酶、RNA酶。

所述的特异性核酸扩增反应试剂包括以下一种或多种试剂：引物、模板、探针、荧光染料。

所述冻干微球的粒径为0.1~5mm。