[发明专利]一步法制备氨基胶体碳及其标记抗体的方法

说明书

本发明涉及一种单分散的氨基胶体碳的制备方法，以及相应的标记抗体的方法。一步法制备氨基胶体碳，步骤包括：将葡萄糖和乙酰葡萄糖溶于稀碱溶液中，于微波消解仪中反应，压力1.0‑1.5MPa，温度为170‑210℃，时间10‑120min；将该产物离心并用水和乙醇洗涤三次，冷冻干燥得氨基胶体碳粉末。所得胶体碳粒径为100‑2000nm，分散性好（PDI0.1），且具有多种可修饰基团，如氨基、羧基、羟基等。利用胶体碳的氨基，使用环氧基分子作为偶联臂，共价结合形成碳‑抗体复合物，步骤包括：使用缩水甘油醚在碱性环境下活化氨基胶体碳，将偶联臂接于胶体碳的氨基部位，再加入抗体，通过开环反应偶联至连接分子的另一端；加入BSA封闭后，将产物离心，用BSA溶液洗涤两次，再用复溶液复溶至初始体积，即得胶体碳‑抗体复合物。该标记方法避免了胶体碳酸性或中性条件活化时易聚集的问题，通过共价键偶联，复合物更稳定。

技术领域

本发明属于碳纳米材料制备和免疫检测分析技术领域，涉及一步法制备氨基胶体碳，与之对应的抗体标记方法，以及在生物免疫检测领域的潜在应用。

背景技术

免疫层析分析方法是药残、真菌毒素快检领域常用的方法，具有操作简便、快速定性或半定量、灵敏度较高等特点，对于大量样本的现场初筛具有很大优势，目前市面上主要是胶体金免疫层析产品。相比于胶体金，胶体碳有着独特的优势：原料来源广泛、廉价，容易制备，成本更低，受pH值和盐浓度等因素影响小，更稳定；抗体标记效率高；黑白色差大，信噪比高，灵敏度更高，检测范围更广；生物兼容性好，无污染，更环保。自1993年VanAmerongen 等人将胶体碳作为一种新的标记物，用于免疫检测以来，胶体碳在生物快检领域得到了长足的发展，使之替代胶体金成为可能。

胶体碳的制备方法主要有水热法、超声法、模板法等，其中水热法具有成本低、产量高，所得产物富含丰富的官能团等特点，微波水热法进一步降低了反应时间，提高了反应时效，通常前驱体有葡萄糖、蔗糖、果糖等，可制得粒径为100-2000nm的胶体碳。胶体碳的蛋白标记通常是靠电荷吸附，也可用胶体碳上的官能团偶联，如一般采用EDC/NHS活化羧基再与蛋白的氨基偶联，因此种偶联方法在酸性环境下活化羧基最佳，而在酸性环境下，带羧基的胶体碳容易聚集，所以活化效率不高。胶体碳在碱性条件下溶解性很好，因此，需要开发一种具有氨基官能团的胶体碳，以及在碱性环境下偶联的方法。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供了一种新的胶体碳的制备方法，该胶体碳富含伯氨基，同时也含有大量的羟基、羧基、醛基等其它可修饰基团。

为实现以上目的，本发明的技术方案是这样实现的：

1、一种新的氨基胶体碳的制备方法，包括如下步骤，

1）将糖类和酰氨糖类按比例2-10:1溶于稀碱溶液中，于微波消解仪中反应，反应压力为1.0-1.5MPa，温度为170-210℃，时间10-120min。

2）将步骤1）所得产物离心，洗涤数次得沉淀。

3）将步骤2）所得沉淀冷冻干燥得固体粉末，即为氨基胶体碳。

优选的，步骤1）中糖类选择葡萄糖，酰氨糖类选择N-乙酰-D-氨基葡萄糖，优选比例为4:1。

优选的，步骤1）中稀碱溶液选择5mM的NaOH溶液， 葡萄糖浓度为10%（w/v），乙酰氨基葡萄糖浓度2.5%（w/v）。

优选的，步骤1）微波消解仪设置为压力主控1.2Mpa，温度185℃，时间为20min，功率400W。

优选的，步骤2）离心力8000g 15min，洗涤溶液为水和乙醇，各洗涤三次。

优选的，步骤3）冷冻干燥时间为6-10小时。

优选的，步骤1）-3）所得胶体碳粒径为200nm，PDI0.1。