[发明专利]一种细胞支原体检测引物、试剂盒及检测方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细胞支原体检测引物、试剂盒及检测方法；本发明中所述试剂盒包括PCR扩增所需要的两对引物组合，该引物组合可以特异性扩增各种支原体中的16S基因和23S基因之间约250bp序列，同时两对引物扩增保证了检测结果的准确性，试剂盒中还包括PCR扩增所需要的预先反应混合物，混合物中包括Taq酶、dNTP和缓冲液等；本发明中的试剂盒可以快速高效的区别细胞中是否存在支原体污染，检测结果准确，同时可以批量进行检测。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种细胞支原体检测引物、试剂盒及检测方法。

背景技术

支原体是一种大小介于细菌和病毒之间（0.1 - 0.6μm）没有细胞壁的原核细胞型微生物。由于支原体大小非常小，大约有1%的支原体能通实验室常规0.2μm孔径的过滤菌膜，同时支原体能在人工培养基培养中易繁殖，支原体污染已经成为细胞培养中一种主要的污染源。多数支原体对一般的抗生素均不敏感因而很难杀死支原体，而轻度污染后的细胞无论是肉眼观察还是在普通显微镜下观察细胞状态均无变化。因此极易忽视支原体污染问题。已有的报道显示世界各国细胞系支原体污染的比例高达30-60%。支原体污染细胞后能改变细胞所有的功能：如细胞内DNA、RNA和蛋白质表达水平，使得实验结果的真实性和可靠性都发生了改变。目前许多杂志投稿都要求培养的细胞都要进行支原体检测。

目前检测细胞支原体污染的主要方法有：①DNA荧光染色法；②分离培养法；③核酸杂交法；④扫描电镜检测法。但这几种检测方法都存在检测精密度不准确、检测过程复杂、耗时同时费用昂贵等缺点。

随着分子生物学技术的发展，目前已发展的最方便快捷的检测方法为PCR检测。该方法主要根据支原体的rRNA基因序列在不同支原体之间高度保守，而16S基因和23S基因之间在不同亚种之间有着序列和长度的不同。通过在此区间设计套式PCR引物扩增，利用琼脂糖凝胶电泳进行检测。该方法具有灵敏度高、检测时间短以及检测费用便宜等优点。目前已经公开的一些PCR检测方法主要通过支原体rRNA序列保守合成引物进行PCR扩增，但这些方法对实验环境要求高，并且实验成本较昂贵，最主要还容易出现假阳性等现象，检测的支原体品种有限。

发明内容

本发明的目的在于提供一种快速检测细胞支原体的引物、试剂盒和检测方法，具体来说本发明涉及PCR扩增支原体所包含的全部组成成分和详细步骤。

本发明提供了快速检测细胞支原体的引物，该引物是根据不同支原体rRNA基因序列保守设计(NCBI 数据库https://www.ncbi.nlm.nih.gov/refseq/)，包括外部引物和内部引物。

其中，外部引物的正向引物序列为：ACACCATGGGAGCTGGTAAT(MICO S1，SEQ.ID.NO.1)；外部引物的反向引物序列为：CTTCWTCGACTTYCAGACCCAAGGCAT (MICO A1，SEQ.ID.NO.2)；其中W和Y为兼并引物，W和Y为A、T、G或C中任何一种碱基。

其中，内部引物的正向引物序列为：GTTCTTTGAAACTGAAT (MICO S2，SEQ.ID.NO.3)，内部引物的反向引物序列为：GCATCCACCAWAWACTCT (MICO A2，SEQ.ID.NO.4)；其中W为兼并引物，W为A、T、G或C中任何一种碱基。

本发明还提供一种快速检测细胞支原体的试剂盒，所述试剂盒包括上述快速检测细胞支原体的引物，其中，各个引物浓度为200pmol/µL。