[发明专利]一种利用液相色谱串联质谱检测鱼类小清蛋白的方法

说明书

本发明提出一种利用液相色谱串联质谱检测鱼类小清蛋白的方法，包括如下步骤：步骤1：特征肽段的选择；步骤2：制作标准曲线：以定量肽段标准品的浓度值为横坐标，以其定量子离子峰面积作为纵坐标绘制标准曲线，得到方程；步骤3：待测鱼肉样品经处理酶解后得到的上清液进行HPLC‑MRM‑MS/MS检测，得到鱼肉样品中定量肽段子离子峰面积，求得样品中定量肽段浓度，进而得到样品小清蛋白浓度。本发明目的在于建立一种液相色谱串联质谱方法，该方法具有准确、精密和灵敏等优点。

技术领域

本发明属于食品过敏原的检测方法，具体涉及一种液相色谱串联质谱检测鱼类主要过敏原小清蛋白的方法。

背景技术

目前国内外对鱼肉中小清蛋白的检测方法虽然有不少报道，主要有酶联免疫法(ELISA)、聚合酶链式反应法(PCR)及液相色谱串联质谱法(HPLC-MS/MS)。其中ELISA方法最为常用，它是根据抗原抗体特异性结合的原理，通过双抗体夹心法、间接法及竞争法等对过敏原进行定量检测，但是存在重复性和特异性较差的缺点：同一种但来自不同厂家ELISA试剂盒所测的结果差别较大，主要因抗体的来源及效价不同而导致；此外，食品中的基质干扰也会影响ELISA方法的准确性，当基质中含有其他能够与抗体结合的杂蛋白时，会出现假阳性，当基质中内源干扰物影响过敏原与抗体结合时则出现假阴性，尤其是在食品被加工后(蒸煮、油炸、高压)，过敏原被修饰，结构发生变化，致使其不能与抗体发生特异性结合。聚合酶链式反应法(PCR)通过检测特征DNA片段对过敏原进行定量检测，该方法与ELISA相比，特异性较强、灵敏度高、对样本纯度要求低，但是仍有一定的缺陷，如DNA在食品加工过程中易被降解分离；食品基质、加工过程中的交叉污染等会对PCR扩增过程抑制，易出现假阴性。

液相色谱串联质谱法检测过敏原利用液相系统对食品中不同的组分进行高效地分离，以减少基质的干扰，利用质谱电离技术对过敏原的特征肽段进行定性定量分析，很大程度上减少基质的干扰，防止出现假阳性和假阴性结果。目前为止，国内外利用液相色谱串联质谱方法检测鱼肉中小清蛋白的研究主要集中在对小清蛋白定性方面，定量方面的研究还未见报道。

小清蛋白是鱼类的主要过敏原，它是一种水溶性钙结合蛋白，分子量大约为12ku，等电点(pI)为3.9～5.5，存在不同的亚基，最常见的为α-小清蛋白和β-小清蛋白，其中β-小清蛋白是最主要的过敏原。

发明内容

为了解决现有技术中的问题，本发明提出一种利用液相色谱串联质谱检测鱼类小清蛋白的方法，包括如下步骤：

步骤1：特征肽段的选择，包括如下步骤：

⑴从NCBI和UniProt蛋白库搜索到小清蛋白氨基酸序列；

⑵将该氨基酸序列导入Skyline软件，模拟酶解过程，得到一系列肽段；

⑶选择物种同源性高，8-25个氨基酸的肽段，并且尽量避免易被修饰蛋白；

⑷将酶解后的肽段进行质谱检测，选择响应高、重复性好的肽段作为小清蛋白的定量肽段；

⑸将肽段进行化学合成，制备纯度高于95％的标准品；

步骤2：制作标准曲线：以标准品的浓度值为横坐标，以定量肽段的定量子离子峰面积作为纵坐标绘制标准曲线，得到方程，若线性范围广，可用log函数值作标准曲线；

步骤3：待测鱼肉样品经处理酶解后，将得到的上清液进行HPLC-MRM-MS/MS检测，得到鱼肉样品中定量肽段子离子峰面积，求得样品中定量肽段浓度，进而得到样品小清蛋白浓度。

进一步的，步骤3中鱼肉样品的处理酶解包括如下两步：

步骤3.1：待测样品处理：

将鱼肉与Tris溶液按照1：4比例混合匀浆，离心后取上清，90℃加热3min，离心取上清液；