[发明专利]一种锦鲤疱疹病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法

说明书

本发明公开了一种锦鲤疱疹病毒的RT‑PCR检测试剂盒及其检测方法，所述的引物组包括引物S1、S2，其中：S1:5’‑AAGGCTTAGTAGCTTACCAT‑3’,S2：5’‑CAAGGTAGCTGAGTCGACCTATG‑3’，S3：5’‑ATAAGGGCTGAGTCCTGAT‑3’。本发明设计特异性引物S1、S2和S3，能够对锦鲤疱疹病毒进行特异性扩增。本发明的专用试剂盒具有很强的敏感性，且与病毒分离和IFA等方法相比符合率可达100％，能够广泛用于锦鲤疱疹病毒的鉴别诊断。

技术领域

本发明涉及兽医生物病毒检测技术领域，具体涉及一种锦鲤疱疹病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法。

背景技术

锦鲤疱疹病毒(Koi herpesvirus)，简称KHV。因其主要是由DNA类疱疹滤过性病毒感染所引起，又名鲤鱼肾炎及鳃坏疽病毒，亚洲地区于2004年也被报导感染锦鲤疱疹病毒。我国将其列为二类动物疫病，是世界动物卫生组织(OIE)必须申报的疾病。又称鲤疱疹病毒3型(CyHV-3)属疱疹病毒科，病毒有囊膜，核衣壳为二十面体，直径170～230nm，病毒核酸为双链DNA。该病多发于春、秋季，潜伏期14d，发病出现症状后24～48h开始死亡，2～4d内死亡率迅速，可达到80％～100％。

由于该病锦鲤和鲤的死亡率高达75％～95％，对水产养殖业危害极大，且锦鲤疱疹病毒病目前无有效的药物和商品化的疫苗用于治疗，故建立一种锦鲤疱疹病毒的反转录PCR诊断方法和专用试剂盒，能够方便在疫病发生早期快速、准确的诊断疫病，为疫病的防控提供有效的参考。

发明内容

有鉴于此，本发明的目的在于提供一种锦鲤疱疹病毒的RT-PCR检测试剂盒及其检测方法，该试剂盒能够快速区分锦鲤疱疹病毒。

为了实现上述目的，本发明所采用的技术方案是：

一种锦鲤疱疹病毒的RT-PCR检测试剂盒，所述的引物组包括引物S1、S2、S3，其中：

S1：5，-AAGGCTTAGTAGCTTACCAT-3，；

S2：5，-CAAGGTAGCTGAGTCGACCTATG-3，；

S3：5，-ATAAGGGCTGAGTCCTGAT-3，。

一种所述的引物组在制备用于锦鲤疱疹病毒鉴别诊断试剂盒中的应用。

一种所述的引物组的锦鲤疱疹病毒鉴别诊断试剂盒。

所述的试剂盒还包括核酸提取试剂、反转录试剂、PCR扩增试剂、和/或琼脂糖凝胶电泳试剂。

所述的反转录试剂包括10×M-MLV缓冲液、dNTP、M-MLV反转录酶、RNase酶抑制剂、S2引物。

所述的PCR扩增试剂包括10×PCR扩增缓冲液、dNTP、S1引物、S2引物、TaqDNA聚合酶和双蒸水。

所述的PCR扩增试剂所构建的PCR扩增体系为：10×PCR扩增缓冲液5.0μL、2.5mmol/LdNTP8.0μL、10mmol/LS1引物1.0μL、10mmol/LS2引物1.0μL、5U/μLTaqDNA聚合酶1.0μL、模板3.0μL，补加双蒸水至50μL。

一种所述的试剂盒的使用方法，包括核酸提取、反转录、PCR扩增和琼脂糖凝胶电泳。

所述的PCR扩增条件为：95℃预变性5min；94℃变性30s，57℃退火30s，72℃延伸90s，共35个循环；最后72℃延伸10min。

本发明的有益效果：