[发明专利]一种GLP-1类似物生物活性的检测方法

说明书

本发明属于生物技术领域，具体涉及GLP‑1类似物生物活性的检测方法，尤其是利拉鲁肽和杜拉鲁肽生物活性的检测方法。本发明通过用细胞培养基稀释细胞HEK293/GLP1R，用含磷酸二酯酶抑制剂的溶液稀释对照品和供试品，再用试剂盒检测刺激后细胞内cAMP水平变化，用多功能酶标仪进行读数测定，最后用统计软件拟合实验数据，通过公式计算得供试品的生物活性。该方法较之前的试剂盒检测方法更为准确、快速，且重复性更高，故符合生物制品生物学活性测定方法的要求。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种GLP-1类似物生物活性的检测方法。

发明背景

近年来，随着社会经济发展、人口老龄化或生活方式西方化，糖尿病发病率日益提高。流行病学调查结果显示，中国已经成为全世界糖尿病第一大国。糖尿病是一组以高血糖为特征的代谢性疾病，在世界范围内日益严重威胁人类健康。胰高血糖素样肽-1(Glucagon-Like Peptide-1，GLP-1)受体激动剂类药物是一类新型抗糖尿病药物，是人体内一种肠源性多肽类激素，具有促进胰岛素分泌、促进胰岛β细胞增殖和分化的功能，其降糖作用具有血糖依赖性的特点，用药期间低血糖发生风险较低。由于它对胰岛素的刺激具有葡萄糖依赖性，因此不引起低血糖症状。

天然GLP-1因在体内半衰期短不适合临床实用。故开发了很多GLP-1类似物以满足临床治疗作用，现有的GLP-1类似物包括艾塞那肽、利拉鲁肽、利司那肽、阿必鲁肽、杜拉鲁肽、索玛鲁肽、Taspoglutide、ITCA650以及LAEx40等。

上述GLP-1及其类似物与细胞膜上GLP-1受体(G蛋白偶联受体)相互作用后，细胞内腺苷酸环化酶(adenylatecyclase)被激活，导致胞内cAMP水平升高。通过检测胞内cAMP的水平可计算出对应的GLP-1及其类似物的生物活性。因此，胞内cAMP水平检测法被广泛用于定量测定GLP-1及其类似物的体外生物学活性，目前常用试剂盒来检测细胞内cAMP的水平，但是试剂盒即使在熟练地操作人员操作下，检测结果重复性差，仍很难稳定地得到量效曲线，致使实验费时费力，尤其对于成本高的生物制品的检测而言，更是消耗财力。

发明内容

本发明为了解决上述难题，提供了一种改进的GLP-1类似物的生物活性检测方法。目前市场上的cAMP试剂盒在操作步骤中都会要求在细胞悬液的制备时加入磷酸二酯酶抑制剂，以防止细胞中的cAMP发生降解。

本发明改变传统思维，在细胞用对照品和供试品刺激之前不加入防止胞内cAMP降解的磷酸二酯酶抑制剂，同时将cAMP试剂盒中惯用的蛋白封闭液由BSA溶液改为8％-12％的FBS溶液。通过大量的实验发现，改进后的方法能够稳定准确地得到GLP-1类似物剂量效应曲线，且重复性更高。

本发明建立了一种GLP-1类似物的生物活性检测方法，所述方法包括如下步骤：

一种GLP-1类似物生物活性检测方法，所述方法使用cAMP检测试剂盒，包括以下步骤：

(1)用完全培养基稀释细胞，所述完全培养基中含8％-12％FBS；

(2)用含磷酸二酯酶抑制剂的稀释缓冲液配制GLP-1类似物对照品溶液和供试品溶液；

(3)将步骤(1)稀释后的细胞加入各孔板中，然后在不同孔板中分别加入步骤(2)配制的对照品溶液和供试品溶液，在37℃下进行孵育；

(4)用cAMP试剂盒检测GLP-1类似物刺激后细胞内cAMP水平变化，用酶标仪进行检测读数；

(5)计算生物活性。

本发明步骤(1)中，优选的细胞为HEK293/GLP1R。

本发明步骤(1)中，优选的完全培养基为DMEM培养基、1％青霉素/链霉素溶液以及8％-12％FBS的混合溶液。