[发明专利]一种纤维素酶和酵母菌共固定化磁性微球的制备方法

说明书

本发明提供了一种纤维素酶和酵母菌共固定化磁性微球的制备方法，依次制备四氧化三铁纳米粒子悬浮液和四氧化三铁纳米粒子的乙醇水悬浮液，再由四氧化三铁纳米粒子的乙醇水悬浮液的氨基化反应制备氨基化的四氧化三铁纳米粒子悬浮液；分别配置纤维素酶酶液和酵母菌菌液，在纤维素酶酶液和酵母菌菌液中分别加入海藻酸钠和氨基化的四氧化三铁纳米粒子，制备海藻酸钠‑纤维素酶溶液和四氧化三铁纳米粒子‑酵母菌溶液，两种溶液混合后滴加至氯化钙中，得到纤维素酶和酵母菌共固定化磁性海藻酸钙微球。本发明制备的磁性纤维素酶‑酵母菌海藻酸钙微球中的四氧化三铁纳米粒子分散较为均匀，且增加磁性粒子中酵母菌及纤维素酶的含量。

技术领域

本发明涉及工业发酵领域，具体涉及一种纤维素酶和酵母菌共固定化磁性微球的制备方法。

背景技术

共固定化是将不同的酶与酶、细胞与细胞或细胞与酶同时固定与统一在体内形成共固定化系统的一种技术，综合了混合发酵和固定化技术的优点。共固定化后的颗粒可以回收，反复利用，实现连续化大规模生产。根据需要可以制成不同的形状，缩小反应器的体积，节省费用，减少反应器占地面积，提高产量，节省劳动力，充分利用资源等优点，固定化酶或细胞在生产和应用领域必将会不断扩大。

适用于固定化技术的常用载体包括有机载体、无机载体及高分子载体等，高分子载体一般还可分为天然高分子材料和人工合成高分子材料，其中天然高分子材料因其良好的生物相容性，能够很好的适用于酶及细胞的固定化，毒性较小，是常用的一种固定化载体。将四氧化三铁纳米粒子应用于固定化技术，可以通过磁分离使得体系中酶的回收变得方便，提高酶的使用效率。常用的制备磁性固定化粒子的方式是先制备四氧化三铁纳米粒子，在通过直接将四氧化三铁纳米粒子包裹在海藻酸钙中的方式制备，这样制备出来的磁性海藻酸钙微球中的四氧化三铁纳米粒子分散度较小，容易在微球内团聚，使磁性海藻酸钙微球中的磁性粒子分散不均匀，同时未加以固定的团聚的四氧化三铁纳米粒子在吸附过程中容易对微球内的酶及细胞、微球外层的海藻酸钙产生一定冲击力，进而对微球及酶或细胞造成损害，影响磁性微球的完整性，不利于在生产中的反复利用。

发明内容

为解决上述问题，本发明提供一种纤维素酶和酵母菌共固定化磁性微球的制备方法，通过制备四氧化三铁纳米粒子-酵母菌溶液，再通过与海藻酸钠-纤维素酶溶液混合并滴入至氯化钙溶液中，制备磁性纤维素酶-酵母菌海藻酸钙微球，磁性微球中的四氧化三铁纳米粒子分散较为均匀，且增加磁性粒子中酵母菌及纤维素酶的含量。

为了实现上述目的，本发明采用的技术方案为：

一种纤维素酶和酵母菌共固定化磁性微球的制备方法，其特征在于：具体步骤为：

步骤一、将浓度为0.3mol/L的硝酸亚铁和浓度为0.2mol/L的氯化铁溶液按照摩尔比2:1的比例加入去离子水中，加热至65~75℃，在搅拌条件下向混合溶液中逐滴加入1mol/L的强碱溶液，继续搅拌30~60min，得四氧化三铁纳米粒子悬浮液；

步骤二、步骤一中得到的磁流体悬浮液设置外加磁场，将四氧化三铁纳米粒子从步骤一的反应体系中分离，分离得到的四氧化三铁纳米粒子中重新注入去离子水清洗多次，最后向清洗过后的四氧化三铁纳米粒子注入体积比为1：1的乙醇水溶液，超声分散，得到四氧化三铁纳米粒子的乙醇水悬浮液；

步骤三、在搅拌条件下向步骤二得到的四氧化三铁纳米粒子的乙醇水悬浮液中滴加无水乙酸，调节PH至4~5，向酸化后的乙醇水悬浮液中通入氮气继续搅拌并加热，加热至60~70℃时加入1ml的3-氨丙基三乙氧基硅烷，继续搅拌反应10~12h，反应完毕后自然冷却老化，依次用去离子水和无水乙醇进行清洗，再依次进行过滤和干燥，最后注入去离子水超声，配置为1g/L的氨基化的四氧化三铁纳米粒子悬浮液，将氨基化的四氧化三铁纳米粒子悬浮液放入4℃冷藏备用；