[发明专利]大丽轮枝菌酵母双杂交VdGAP－BD诱饵载体的构建和应用

说明书

本发明涉及植物病理学领域，根据前期从大丽轮枝菌V08DF1菌株中克隆的VdGAP基因的全长序列，以大丽轮枝菌野生菌核型菌株V08df1的cDNA为模板，扩增两端带有pGBKT7同源序列的VdGAP片段，与线性化pGBKT7载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得VdGAP‑BD载体阳性克隆。VdGAP‑BD诱饵载体构建成功后，寻找与VdGAP互作蛋白，为解析微菌核和黑色素的形成信号通路提供有益帮助。

技术领域

本发明涉及大丽轮枝菌(Verticillium dahliae)糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白基因VdGAP酵母双杂交VdGAP-BD诱饵载体的构建和应用，属于植物病理学研究领域。

背景技术

大丽轮枝菌(Verticillium dahliae Kleb.)是引起植物黄萎病的重要土传病原真菌，寄主广泛，可危害多种重要的经济作物和园艺作物。传统的防治技术，如轮作、抗性品种选育、化学药剂等对黄萎病的防治有一定的效果，但是由于大丽轮枝菌具有丰富的遗传多样性，致病力易发生分化，且主要以抗逆性强的微菌核结构在土壤中存活，因而在世界范围内黄萎病的危害依然严重。

黄萎病是系统性侵染的单循环病害，微菌核是大丽轮枝菌在土壤中的主要休眠结构，能够在无寄主植物的土壤中长期存活达14年之久，成为植物黄萎病重要的初侵染来源，在病害循环中起重要作用，其形成的数量及存活情况直接影响着黄萎病的发生危害程度。对于大丽轮枝菌微菌核的研究过去集中于微菌核的形态、大小、分布，微菌核的分离培养技术以及影响微菌核存活的土壤环境因素等。对于其发育的过程在形态学层次也已清晰，微菌核由致密的厚壁细胞组成，最初阶段是由单根或数根菌丝膨大，并产生大量的隔膜，隔膜的细胞继续增大，成为球状并产生侧芽，最终在微菌核皮层细胞的细胞壁上和包围在微菌核的纤维网上沉积黑色素颗粒。黑色素对于形成完整的休眠结构是必须的，已有研究表明，黑色素通过外表修饰、抗辐射、抗氧化、清除自由基等作用赋予真菌抵抗紫外辐射、极限温度、干燥、微生物裂解。大丽轮枝菌的微菌核具有很强的抗逆性正是与其含有丰富的黑色素密切相关，因此，探索黑色素合成途径的关键因子，可为探索新型杀菌剂、寻求新的防治方法奠定基础。大多数真菌黑色素是以1，8二羟基萘酚(DHN)作为前体合成的，就是通常所称的DHN黑色素。DHN黑色素普遍存在于子囊菌和半知菌中，如葫芦剌盘孢、水稻胡麻斑菌、链格孢的黑色素合成途径即为DHN途径。大丽轮枝菌基因组中也发现编码NPRS和PKS的基因，并且基于NPRS和PKS在基因组中的分布及黑色素的特点，认为NPRS和PKS都可能参与微菌核黑色素的生物合成。但对于微菌核和黑色素形成和发育的分子机制并不明确。本实验室前期通过对大丽轮枝菌糖基磷脂酰肌醇锚定蛋白基因VdGAP敲除与回补，证明该基因参与大丽轮枝菌黑色素的形成。在此基础上，构建酵母双杂VdGAP-BD诱饵载体，寻找与VdGAP互作蛋白，为解析微菌核和黑色素的形成信号通路提供有益帮助。

发明内容

具体实验方法为以大丽轮枝菌野生菌核型菌株V08df1的cDNA为模板，扩增两端带有pGBKT7同源序列的VdGAP片段，与线性化pGBKT7载体连接，转化至大肠杆菌感受态细胞DH5α，获得VdGAP-BD载体阳性克隆。

相关技术路线如下：

1.前期已通过RACE获得VdGAP的ORF，参照擎科的TreliefTM SoSoo Cloning Kit定向克隆说明书，设计核酸引物(两端带有pGBKT7同源的15bp序列)，采用高保真PCR体系扩增VdGAP，同时BamH I和EcoR I双酶切pGBKT7载体质粒，琼脂糖凝胶电泳分别回收扩增片段和酶切片段。

2.采用擎科的TreliefTM SoSoo Cloning Kit定向克隆方法将VdGAP扩增回收片段和pGBKT7载体线性化回收片段连接，转化至DH5α，获得VdGAP-BD重组载体。

附图说明