[发明专利]一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法

说明书

本发明涉及一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法，首先提取待测样品的基因组DNA；再根据IHHNV的相关序列设计引物和TaqMan探针，最后采用设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。本发明的检测方法检测灵敏度高且特异性好，可以检测到的最低拷贝数为7，用时短且不会出现假阳性的情况，可应用于我国对虾养殖中的分子疾病检测和早期预警，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

传染性皮下及造血组织坏死病毒(IHHNV)是单股DNA小病毒。是目前已知的对虾病毒中颗粒最小的一种，病毒粒(Virion)直径约22nm(纳米)，无套膜(Nonenveloped)，20面体(Icosahedron)对称的球状颗粒.IHHNV感染对虾的部位，包括外胚层组织，如鳃、表皮、前后肠上皮细胞、神经索和神经节；以及中胚层器官，如造血组织、触角腺、性腺、淋巴器官、结缔组织和横纹肌。在宿主细胞核内形成包涵体。在白对虾(Litopenaeus vannamei)则引起矮小畸形症候群(Runt-deformity syndrome，简称RDS)，成长缓慢且不齐，额角弯向一侧，第六腹节及尾扇变形或变小，造成高达50％的经济损失。传染性皮下及造血组织坏死病毒IHHNV)容易被忽略，因为IHHNV感染南美白对虾，不会导致死亡。南美白对虾在感染IHHNV之后，有可能终身带原，并透过垂直传染途径感染子代，或透过食物链或互相残食或水体而引起水平感染，其中以吃食病虾的传染性最高。IHHNV自1983年在夏威夷首次爆发至今，目前已经公布全基因组序列有夏威夷株、印度株、韩国株、中国福建株、中国赣榆株、中国射阳株。为了防止IHHNV的爆发，目前可以采取以下几个措施防范：严格筛选IHHNV-free的对虾作为亲本来孵育虾苗；受精卵和幼体必须严格消毒；虾苗养殖场的水源、设备、管道等等需要定期彻底消毒，以及需要一定的生物安全防护系统；在养殖塘中放养Specific-Pathogen-Free(SPF)虾苗，定期的对虾塘进行IHHNV生物诊断等。

IHHNV的诊断技术有两种，即组织学检测和分子生物学诊断。目前的分子生物学诊断方法主要有PCR方法、套式PCR、荧光定量染料法、LAMP法等。PCR方法具有高灵敏度的优点，但一般PCR产物需要通过琼脂糖凝胶电泳和溴化乙锭染色紫外光观测结果，不仅需要多种仪器而且费时费力却危害身体健康。套式PCR则需要两对引物，费时长；荧光定量染料法则根据原理可知会有假阳性且成本较高等缺点。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法。

技术方案

本发明人采用TaqMan探针法对对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒进行定量检测，该检测方法比普通的PCR灵敏度更高，也克服了常规PCR和SYBR Green PCR的许多缺点。目前在水产养殖动物的常规病原体检测中建立快速准确的方法，是适应口岸快速检测和大通关的时代要求，对促进中国海洋养殖及其产品的贸易有重要作用。具体方案如下：

一种对虾传染性皮下及造血组织坏死病毒的定量检测方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)根据IHHNV的相关序列设计引物和TaqMan探针：

上游引物序列：5'-CGACTTTATTGAAGGGACTC-3'

下游引物序列：5'-AGTCTTCTTGGTTGTGGTTT-3'

TaqMan探针的序列为：5'-CGCCTTCCGTCCATTTCGT-3'；

(3)采用步骤(2)设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。