[发明专利]一种利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法

说明书

本发明涉及一种利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法，首先提取待测样品的基因组DNA；再设计引物和TaqMan探针，最后通过设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。发明的检测方法检测灵敏度高且特异性好，可以检测到的最低拷贝数为7.8，用时短且不会产生假阳性的情况，可应用于我国对虾养殖中的分子疾病检测和早期预警，具有良好的应用前景。

技术领域

本发明涉及一种定量检测对虾白斑综合症病毒(WSSV)的方法，属于分子生物学技术领域。

背景技术

对虾白斑综合症病毒(WSSV)在1992首次被发现以来已成为对虾养殖业中最危险的传染源，其在十足目甲壳动物中宿主范围广泛。WSSV基因组是一个均匀分布的圆形的dsDNA 分子，不同毒株基因组大小不同，是迄今为止已测序的最大的病毒基因组之一。三个WSSV 毒株的基因组的全序列已经测定，包括：泰国株293kbp，中国株305kbp和台湾地区株307kbp，它们之间的相似度为99.3％。WSSV基因组的不同区段具有重要的序列差异，这些差异可用于确定WSSV毒株的起源和传播，也用于区分野外的毒株，也可能导致PCR检测出现假阴性。WSSV无包涵体包被，完整的有囊膜的病毒粒子长210nm～380nm，宽70nm～167nm，一个尾状的附着器结构在病毒粒子的一端。囊膜厚6nm～7nm，核衣壳位于囊膜内，是由球状蛋白堆积形成的环状结构，球状蛋白直径约为10nm，排列在14个～15个垂直的环纹上，在长轴上每隔22nm有一个球状蛋白，最终形成一个交叉螺线状的结构。

在池塘中，感染白斑综合症病毒的对虾聚集在塘边，症状出现1或2天后发生死亡，10 天内累计死亡率可达到100％。在养成池，成年对虾和幼虾都对WSSV敏感，大规模的死亡通常发生在放养1或2个月后。许多感染WSSV的对虾外壳出现明显的直径在0.5mm～3.0mm的白点或白斑，同时伴随其他症状，包括身体和附肢变红、摄食减少、应激反应敏感、表皮易脱落、鳃盖肿胀，肝肿大颜色偏黄，血淋巴变稀、凝血延迟。

传统检测方法以病理学和电子显微镜观察为主，耗时长且不适用。近年来广泛建立的免疫检测技术、原位杂交、PCR检测法、核酸探针杂交法、荧光定量法，不仅迅速、简便、实用，而且大大提高了检测灵敏度，可以检测出潜在感染和早期感染。单种检测方法通常存在缺陷，而多种方法同时检测不仅耗时且结果有差异，所以需要建立一种准确的定量检测对虾白斑综合症病毒的方法。

发明内容

本发明的目的在于解决现有技术的不足，提供一种利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法。

技术方案

一种利用TaqMan探针定量检测对虾白斑综合症病毒的方法，包括如下步骤：

(1)提取待测样品的基因组DNA；

(2)设计引物和TaqMan探针：

上游引物序列：5'-CAAGGGAAC TGT CGC TTC-3'

下游引物序列：5'-CCAAGATCG GCGATAAGT-3'

TaqMan探针的序列为：5'-CAT GCCAGC CGT CTT CCAG-3'；

(3)采用步骤(2)设计的引物和TaqMan探针对待测样品的基因组DNA进行荧光定量PCR检测。

进一步，步骤(3)中，所述荧光定量PCR检测的反应体系为20μL，包括2×SuperRealcolor PreMix 10μL，上游引物、下游引物各0.6μL，TaqMan探针0.4μL，ddH₂O 7.4μL，模板DNA 1μL。

进一步，步骤(3)中，所述荧光定量PCR检测的反应程序为：95℃预变性15min；95℃变性15s，61℃退火60s，采集荧光信号，40个循环。