[发明专利]一种蓖麻原生质体制备和转化方法

说明书

本发明公开了一种蓖麻原生质体制备和转化方法。本发明通过优化蓖麻叶片原生质体分离制备中叶片材料获取时间、切取叶片的形状、酶浓度、酶解时间和离心转速等，并利用自制的简易装置过滤，获得更多活力较强的原生质体，并利用本发明的方法成功的将外源质粒转化蓖麻叶片原生质体，可以用于进一步的亚细胞定位。本发明为蓖麻功能基因的分析建立了一套高效的蓖麻叶片原生质体制备和转化方法及亚细胞定位体系，利用这套体系可以高效的获得蓖麻叶片原生质体，为获得进行亚细胞定位提供了前提条件，进一步为蓖麻关键功能基因研究奠定了良好的工作基础，为蓖麻原生质体的应用提供技术支持。

技术领域

本发明属于植物生物技术领域，具体涉及一种蓖麻原生质体制备和转化方法。

背景技术

原生质体(protoplast)一词是Hanstein在1880年提出的，是指植物细胞去掉细胞壁而被原生质膜包裹的那部分裸露的物质。该裸露的物质具有其自身的全部遗传信息，在适宜的条件下培养，可以再生成和其亲本相似的个体；离体的原生质体具有广泛的用途，不但能通过细胞的融合克服远缘杂交不亲和的障碍，而且是进行基因工程操作，尤其是进行基因的瞬时表达的理想受体，因此科学家们越来越重视原生质体的游离技术。

植物原生质体遗传转化常见的方法有基因枪法、农杆菌共培养转化法、电击穿孔转化法和聚乙二醇(PEG)介导转化法等。其中最常用的是PEG介导转化法，该方法不仅成本低，操作简单，而且还可以很大程度地保持原生质体的活性，是进行植物原生质体转化的第一首选。其基本原理是：PEG带有大量负电荷，可以与水分子以及Ca²⁺结合，并且连接原生质体表面的负电荷，形成静电键，从而引起细胞质膜电荷紊乱甚至会产生微孔，使外源DNA可以通过这些孔隙进入细胞体内。植物种类、原生质体的活力与密度、质粒DNA的浓度与纯度、PEG的分子量和浓度以及处理时间等均会影响转化效率。目前为止由PEG介导的原生质体转化技术在拟南芥和水稻等模式植物中逐渐趋于成熟，然而还有许多非模式植物尚未建立。

蓖麻是大戟科蓖麻属一年生或多年生草本植物，是世界上十大油料作物之一，具有很高的经济利用价值。目前有关蓖麻原生质体游离和转化的研究还未见报道。

发明内容

本发明针对现有技术中无有关蓖麻原生质体制备和转化方法的问题，提供一种操作简便、能高效的获得活力较强的蓖麻叶片原生质体的制备方法，及利用该原生质体进行遗传转化的方法。

本发明的蓖麻原生质体制备方法，包括以下步骤：

a.利用蓖麻完整的种子幼胚培养无菌苗，培养20天后，取叶片并吸干表面水分，舍去主叶脉部分，把叶片切成0.2mm宽细丝，然后将其浸没于W5溶液中，加入酶解液，25℃、50rpm振荡酶解80min；所述的酶解液，含有16g/L的纤维素酶RS、8g/L的离析酶R-10、 0.5M的甘露醇、20mM MES、10mM CaCl₂和1g/L的BSA，余量为水；

b.去掉酶解液，然后加入W5溶液漂洗酶解后的叶片细丝，收集漂洗后的溶液，利用原生质体过滤装置过滤，收集过滤液，700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心5min，倒去上清液，用W5溶液悬浮原生质体，再700rpm离心10min，去上清，沉淀即为蓖麻原生质体。

优选，所述的无菌苗的培养方法为：挑取成熟饱满的蓖麻种子于蒸馏水中浸泡一天，剥去外壳，使用75体积分数％的乙醇水溶液浸泡1min，再使用质量分数2％的次氯酸钠浸泡并震荡10-15min，最后使用蒸馏水冲洗3-5次后，用无菌镊子剥离蓖麻完整的幼胚接种于MS 基本培养基上，25±1℃、光照强度为2000lx、光照12h/黑暗12h的条件下培养。

优选，所述的W5溶液含有2mM MES、154mM NaCl、125mM CaCl₂和5mM KCl，余量为水。