[发明专利]角膜上皮细胞和角膜支架及其制备方法和应用

说明书

本发明公开了角膜上皮细胞和角膜支架及其制备方法和应用，涉及角膜疾病药物领域。本发明公开的角膜上皮细胞的制备方法，其通过将人胚胎干细胞接种至E6培养基进行培养，使得人胚胎干细胞分化成角膜上皮细胞，通过该制备方法可以持续地提供具有快速增殖能力的角膜上皮细胞，可用于制备角膜支架，或用于制备治疗角膜疾病药物中。

技术领域

本发明涉及角膜疾病药物领域，具体而言，涉及一种角膜上皮细胞和角膜支架及其制备方法和应用。

背景技术

角膜疾病影响世界上数百万人。例如，角膜缘干细胞缺乏(LSCD)的特征在于角膜缘干细胞的丧失，这对角膜上皮细胞(CEC)的再生至关重要。角膜缘干细胞(LSC)通过中间祖细胞分化为CEC^[1]。因此，LSC的损失或不足将导致角膜结膜化，慢性炎症和角膜损伤后潜在的视力丧失^[2]。虽然恢复角膜缘微环境对LSCD早期治疗有一定的作用^[3]，但角膜和LSC移植迄今为止是最有效的方法^[4]。然而，自体LSC的移植有可能会损伤对侧供体眼的健康角膜，而同种异体移植受供体短缺或免疫不相容等条件的限制^[5,6]。所以，人们利用人源性多能干细胞(hPSC)，包括人类胚胎干细胞(hESC)^[7]和诱导多能干细胞(iPSC)[8,9]得到的CEC寻求治疗方案的兴趣正在上升。

至今已有很多关于多能干细胞向CEC分化的方法发表。例如，角膜缘成纤维细胞或LSC^[10-13]的条件培养基，或PA6基质细胞作为饲养层细胞^[14]，或在细胞外基质富集表面^[15]和合成角膜上皮弓形膜^[16]。近期，报道称使用成份确定的培养基来模拟体内的信号传导(如TGF，WNT和FGF信号通路)进行CEC的分化^[17-20]。

此外，人们还研究了工程生物材料，例如修饰的人羊膜，胶原，纤维蛋白，聚(ε-己内酯)，丝素蛋白-壳聚糖和壳聚糖-明胶作为角膜细胞载体^[20-26]。然而，他们通常不符合透明度，机械强度，生物相容性和生物安全性的临床标准。相比之下，脱细胞角膜(DC)已经成为细胞递送的相对安全和可持续的支架，因为它不仅维持角膜结构，强度和光学性质，而且保留了天然基质超微结构。兔DC角膜细胞的再细胞化可以建立一片兔角膜等效物^[27]。用人角膜细胞收集的猪DC获得了类似的结果^[28]。另外，在7％O₂下与角质形成细胞无血清培养基1：1混合的DMEM/F12中的hESC衍生的CEC接种在脱细胞的猪角膜基质上，随后进行空气提升培养以诱导上皮分层^[29]。

传统上，角膜已被认为是体内免疫特有部位之一。然而，免疫排斥仍然是角膜同种异体移植失败的主要原因，包括血管形成，炎症和角膜移植物衰竭^[31]。因此，供者和同种异体受体之间的多态性人白细胞抗原(HLA)分子的差异可以在角膜移植后引起免疫应答^[32]。HLA匹配的供体很难找到，并且需要长期给与免疫抑制剂。为了解决这些问题，科学家们进行了基因操作来产生没有HLAI类或II类分子的所谓“通用”hPSC^[33]。不具有HLA分子表面表达的同种异体细胞对受体的免疫细胞不可见^[34]。

角膜损伤和角膜缘干细胞缺乏损害全球数百万人的视力。虽然同种异体角膜移植是主要的治疗选择之一，但捐赠的角膜短缺和潜在的免疫排斥仍然是其主要障碍。

鉴于此，特提出本发明。

发明内容

本发明的目的在于提供一种角膜上皮细胞的制备方法。

本发明的另一目的在于提供一种角膜上皮细胞。

本发明的另一目的在于提供一种制备角膜支架的方法。

本发明的另一目的在于提供一种角膜支架。