[发明专利]体外培养富集人CD4+和CD8+ TCM细胞的方法

说明书

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种体外培养CD4+/CD8+TCM细胞的方法，更具体地，本发明涉及一种使用刺激物组合从人体外周血单个核细胞中大量定向扩增CD4+/CD8+TCM细胞的方法。本发明的技术方案获得的T细胞增殖数量多、状态好，比例接近人体自然状态，同时TCM细胞的含量高。

技术领域

本发明属于细胞培养领域，具体涉及一种体外培养富集人CD4+/CD8+ TCM细胞(中枢记忆性T细胞)的方法，更具体地，本发明涉及一种使用刺激物从人体外周血单个核细胞中大量定向扩增CD4+/CD8+ TCM细胞的方法。

背景技术

2011年，癌症超过心脏病，成为全球第一大死亡原因。WHO在2013年12月公布，全球每年新增癌症患者数已经超过1400万名，这与2008年的统计结果1270万人相比，人数大幅增加。同期，癌症患者的死亡人数也有所增加，从过去的760万人增加到820万人。根据中国医学科学院肿瘤医院、国家癌症中心赫捷院士、全国肿瘤登记中心主任陈万青教授等在《CA:A Cancer Journal for Clinicians》杂志(2015年影响因子144.8)发表的《2015年中国癌症统计数据》：2015年我国肿瘤新发病例为429.2万。报告称，到2030年，新增癌症病例将增加50％，达到每年2160万人。

针对肿瘤，传统的手术切除、化疗、放射线治疗，对正常组织有伤害，具有局限性，效果有限。近年来出现的靶向疗法在细胞分子水平上针对已经明确的致癌位点来设计相应的治疗药物，药物进入体内会特异地选择致癌位点来与之结合并发生作用，使肿瘤细胞特异性死亡，不会伤及肿瘤周围的正常组织细胞。但分子靶向药物有效性低，某种药物只能对特定突变基因型肿瘤产生作用；肿瘤基因突变产生药物耐受性导致长期的治疗效果下降；存在严重的不良反应；部分肿瘤不能通过靶向药物得到有效治疗。

而免疫疗法恰恰能够解决上述问题。当免疫系统由于自身或肿瘤细胞原因而削弱时，为肿瘤的发生提供有利条件；肿瘤免疫治疗通过调动机体的免疫系统，增强肿瘤微环境抗肿瘤能力，从而控制和杀伤肿瘤细胞。肿瘤免疫治疗就是通过重新启动并维持肿瘤-免疫循环，恢复机体正常的抗肿瘤免疫反应，从而控制与清除肿瘤的一种治疗方法。

2013年免疫抗癌疗法被Science杂志评为年度10大科技突破之首。自2013年以来，肿瘤细胞及免疫疗法不断获得突破性进展，临床研究也取得了巨大成功，是当前肿瘤治疗领域最具前景的治疗手段，有望成为继手术、放化疗方法后的新的常规治疗方法。

随着干细胞生物学、免疫学、分子技术、组织工程技术等的快速发展，细胞免疫治疗作为一种安全而有效的治疗手段，在肿瘤等治疗中的作用越来越突出。当前，新型细胞治疗技术的研究和开发已经成为解决肿瘤等相关疾病的重要研究领域。细胞免疫治疗，是采集人体自身免疫细胞，经过体外培养，使其数量成千倍增多，靶向性杀伤功能增强，然后再回输到人体来杀灭血液及组织中的病原体、癌细胞、突变的细胞，打破免疫耐受，激活和增强机体的免疫能力，兼顾治疗和保健的双重功效。

细胞免疫治疗目前已经广泛开展，从早期的LAK细胞(淋巴因子激活的杀伤细胞)治疗尝试，发展到CIK(细胞因子诱导的杀伤细胞)、DC-CIK细胞(自体树突状细胞刺激CIK细胞)治疗等。CIK细胞由IFN-γ(干扰素-γ)、IL-2(白细胞介素-2)及抗-CD3抗体(OKT3)刺激后分化产生，其中在第0天加入1,000U/ml的IFN-γ，24小时后加入50ng/ml OKT3和300U/mlIL-2，中间间隔2天加入含IL-2的新鲜培养基，之后经过2-3周的培养可得到CIK细胞。当前，CAR-T(嵌合抗原受体T细胞)免疫治疗技术已经成为国际肿瘤治疗研究的热点领域。