[发明专利]检测Kras基因突变的引物、探针、试剂盒及应用

说明书

本发明公开了一种检测Kras基因突变的引物、探针、试剂盒及应用。所述检测Kras基因突变的引物对包括：第一引物，其序列如SEQ ID NO.1～SEQ ID NO.7中的任一者所示；第二引物，其序列如SEQ ID NO.8所示。所述探针的序列与Kras基因第12、13密码子野生型序列互补，并且所述探针序列的中间位置突变位点还包含锁核酸碱基，所述探针序列的3’端是以氨基基团修饰的。所述试剂盒包括至少一引物对和至少一探针，其中一引物对包括前述的第一引物和第二引物，其中一探针为前述的探针。本发明的试剂盒灵敏度高，特异性好，精度高，稳定性高，本发明的检测方法简单快速，整个检测过程耗时短，检测效率很高，成本低。

技术领域

本发明涉及分子生物学技术领域，更具体地，涉及用于DNA技术领域，特别是指一种用于检测Kras基因突变的引物、探针及相应试剂盒，以及利用该试剂盒检测Kras基因突变的方法，以及其在检测Kras基因突变中的用途。

背景技术

Kras是RAS基因家族中的一种，是最常见的发生突变的基因之一，编码位于细胞膜内表面的ras蛋白，在正常生理情况下，通过酪氨酸激酶磷酸化/去磷酸化介导的瞬时活化/失活机制，起到分子开关作用，参与细胞内的信号传导，实现对肿瘤细胞生长以及血管生成等过程的调控。但当Kras基因发生突变后会诱导ras蛋白的永久活化，从而永久激活下游信号，使细胞内信号传导紊乱，从而促进细胞增殖分化，侵袭、转移、逃逸凋亡而发生癌变。

Kras突变主要发生在2号外显子的第12、13位密码子和3号外显子的第61位密码子，占所有突变类型的90％以上。目前，Kras突变在多种癌症组织中均有很高的发生率，如胰腺癌(90％)、结肠癌(40-50％)、肺癌(13％)等。它也使抗EGFR药物如EGFR单克隆抗体-西妥昔单抗、尼妥珠单抗、帕尼单抗及EGFR酪氨酸激酶抑制剂吉非替尼和厄洛替尼等的治疗无效，造成用药失败。因而，2015年美国癌症综合网络(NCCN)指南明确指出侵润性结直肠癌的患者在利用西妥昔和帕尼单抗时，Kras突变为临床用药的必检项目，只有Kras野生型的患者才建议接受EGFR抑制剂的治疗。

目前，Sanger测序是针对基因突变分析的常用技术，其技术原理是利用一种DNA聚合酶来延伸结合在待定序列模板上的引物，直到掺入一种链终止核苷酸为止，使反应得到一组长几百至几千碱基的链终止产物。它们具有共同的起始点，但终止在不同的的核苷酸上，可通过高分辨率变性凝胶电泳或毛细管电泳分离大小不同的片段，从而对序列进行读取，识别突变位点。而高通量测序技术(High-throughput sequencing)能一次并行对几十万到几百万条DNA分子进行序列测定，比sanger测序具有更快的速度和更高的通量。常规的突变扩增阻滞系统(amplification refractory mutation system，ARMS)技术也叫等位基因特异性PCR，也是一种直接用于点突变分析的PCR技术。它利用引物的3’端末位碱基必须与其模板DNA互补才能有效扩增的原理，设计针对突变位点的特异性PCR扩增引物，在严格的条件下，只有在引物的3’碱基与模板配对时PCR扩增才能正常进行，从而对等位基因有效区分而检测突变。

但是目前，针对基因突变分析的Sanger测序和常规的ARMS技术由于灵敏度不够无法满足检测需求。NGS建库技术复杂，常规建库测序方法使得血浆中含量极低的肿瘤信号完全淹没在背景噪声中，造成原始信息丢失严重，限制了其敏感度潜力的发挥。此外，NGS技术专业要求高、检测流程及信息解读难以标准化。NGS技术的性价比也非常低，高灵敏NGS单基因测序单价需5000美元以上，测试完成后需要很长时间(如2周)才能出结果。另外，现有的Kras基因突变试剂盒检测Kras基因突变的灵敏度通常在1％以上，仍有待提高。

因此，目前迫切需要开发一种快速准确、操作简便、灵敏度高的检测Kras基因突变的试剂盒，以满足临床用药和检测诊断的要求。

发明内容

本发明的主要目的就是针对以上现状，提供一种检测Kras基因突变的引物、探针，以克服现有技术中的不足。