[发明专利]高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗及其诱导扩增肿瘤抗原特异性CTL的方法

权利要求书

1.高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗在体外制备肿瘤特异性CTL中的用途，其特征在于，

所述高效荷载肿瘤抗原的DC疫苗的制备方法包括以下步骤：

（1）制备肿瘤抗原；

（2）制备每人份的DC疫苗需从外周静脉抽取40-50ml抗凝血分离单个核细胞；以贴壁的低起始量细胞定向诱导与扩增DC细胞，方法为：获取单个核细胞并洗涤，加入无血清DC细胞培养液重悬细胞，进行细胞计数，调整细胞浓度为3×10⁶-1.5×10⁷个/ml，细胞在孵箱中贴壁培养2-6小时，所得贴壁细胞为DC前体细胞，向DC前体细胞中加入含有rh-IL-4和rh-GM-FCS的无血清DC细胞培养基，孵箱中培养DC前体细胞7-9天，得到有待致敏活化的未成熟DC细胞；

步骤（1）的肿瘤抗原与步骤（2）的外周血来自同一个体或不同个体，取决于临床获取自体肿瘤组织或细胞的可行性以及肿瘤抗原的类型；

（3）用肿瘤抗原和激活剂致敏活化步骤（2）得到的未成熟DC细胞，其中，步骤（3）致敏活化DC细胞的方法为：采用来自外周血供体的自体肿瘤来源的抗原，或根据病人的病理检测结果，加入与病理检测结果相匹配的相应肿瘤的混合肿瘤抗原，同时加入终浓度为0.2-0.8ug/ml的聚肌胞注射液、终浓度2-10 ug/ml的抗人CD40单克隆抗体，孵育得到致敏活化的DC细胞；所述混合肿瘤抗原由肿瘤细胞表面蛋白抗原：肿瘤细胞膜蛋白抗原：肿瘤细胞外泌体按质量比1:1:2组成；

（4）封闭DC细胞表面的PD-L1分子后收获DC疫苗：向致敏活化后的成熟的DC细胞中加入终浓度为1-10 ug/ml的抗人PD-L1抗体，37℃下孵育0.5-2小时收获DC细胞，以封闭DC细胞表面的PD-L1分子；

所述体外诱导肿瘤特异性CTL方法为在患者第一次抽血制备DC疫苗并收获DC的当日，对同一个体第二次抽取40～50mL抗凝外周血，分离并贴壁培养，吸出未贴壁单个核细胞与所述DC疫苗以5:1的比例混合，加入CTL无血清启动培养基，体外抗原提呈后，加入抗人CD3单抗、抗人CD28单抗、rh-IL-2进行CTL培养；

当CTL开始克隆化生长后改为扩增培养基进行扩增培养；CTL培养至细胞对数生长高峰时，在CTL收获之前，加入终浓度为1-10 ug/ml的抗人PD-1单克隆抗体，封闭CTL表面的PD-1分子，孵育0.5-2小时；收集细胞悬液并离心洗涤；留取质控样品；所得CTL用生理盐水重悬，以备患者输注。