[发明专利]大豆转录因子GmWRKY23基因在抗逆中的应用

权利要求书

1.腐霉菌诱导的大豆转录因子GmWRKY23基因在抗逆中的应用；所述抗逆为抗病原菌和抗盐；所述病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；所述GmWRKY23基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。

2.腐霉菌诱导的大豆转录因子GmWRKY23基因在抗逆中的应用方法，其特征在于，所述抗逆为抗病原菌和抗盐；所述病原菌为尖孢镰刀菌(Fusarium oxysporum)；具体步骤如下：

（1）腐霉菌侵染大豆，获得表达GmWRKY23基因的大豆；所述GmWRKY23基因的核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示；

（2）转基因表达载体的构建：以步骤（1）获得的表达GmWRKY23基因的大豆提取的总RNA反转录成的cDNA为模板，根据GmWRKY23基因设计带有酶切位点的引物进行PCR扩增，获得GmWRKY23基因；再通过酶切连接方法将GmWRKY23基因克隆到目的载体上，获得植物表达载体；

（3）农杆菌介导的遗传转化：将植物表达载体转化农杆菌GV3101，得到含有重组质粒的GV3101；利用含有重组质粒的GV3101侵染未萌发大豆的子叶节，用含有草铵膦5mg/L-15mg/L的MS培养基筛选收获的T₀大豆种子，T₁代种植筛选得到T₂代种子，种植T₂代种子，用于检测；

（4）转基因大豆植株的抗性鉴定：转基因大豆病原菌抗性的离体鉴定，转基因大豆的耐盐试验。

3.根据权利要求2所述的腐霉菌诱导的大豆转录因子GmWRKY23基因在抗逆中的应用方法，其特征在于，步骤（1）所述腐霉菌侵染大豆，获得表达GmWRKY23基因的大豆的具体方法如下：

①腐霉菌侵染大豆不同品种的幼根，利用实时定量PCR对GmWRKY23基因的表达量进行分析，选出GmWRKY23基因表达量变化不大的大豆品种；

②以上述GmWRKY23基因表达量变化不大的大豆品种为试材，探索疫霉菌、腐霉菌、立枯丝核菌侵染大豆幼根的基因表达谱，获得表达GmWRKY23基因的大豆。

4.根据权利要求2所述的腐霉菌诱导的大豆转录因子GmWRKY23基因在抗逆中的应用方法，其特征在于，步骤（2）所述转基因表达载体的构建，具体步骤如下：

①将GmWRKY23基因与pGEM-T载体连接，转化DH5α感受态细胞，获得pT-GmWRKY23阳性克隆，提取重组质粒pT-GmWRKY23；

②利用限制内切酶分别对重组质粒pT-GmWRKY23和植物表达载体pCAMBIA3300-GUS进行双酶切，获得含BamH I和Sac I酶切位点的GmWRKY23基因和pCAMBIA3300线状质粒条带，连接转化，获得植物表达载体pCAMBIA3300-GmWRKY23。

5.根据权利要求2所述的腐霉菌诱导的大豆转录因子GmWRKY23基因在抗逆中的应用方法，其特征在于，步骤（4）所述转基因大豆病原菌抗性的离体鉴定方法如下：

①取Southern杂交检测为阳性的大豆和对照大豆的幼嫩叶片，用打孔器切割成叶圆盘，用70%乙醇浸泡5min灭菌，后用20%次氯酸钠浸泡15min，无菌水漂洗5遍；

②将处理好的叶圆盘置于PDA培养基上，后在叶圆盘上分别接种病原菌菌丝，接种后在23～25℃下培养5天；

③5天后根据所接种叶圆盘的菌丝生长情况作为鉴定指标。

6.根据权利要求2所述的腐霉菌诱导的大豆转录因子GmWRKY23基因在抗逆中的应用方法，其特征在于，步骤（4）所述转基因大豆的耐盐试验，具体步骤如下：将野生型的大豆种子置于添加不同浓度NaCl的MS培养基上，观察种子发芽后幼苗的生长情况，从而确定合适的耐盐浓度；将GmWRKY23转基因株系和野生大豆种子分别放在相同NaCl浓度的MS培养基上，培养25天后观察其幼苗的生长情况。

7.根据权利要求6所述的腐霉菌诱导的大豆转录因子GmWRKY23基因在抗逆中的应用方法，其特征在于，所述NaCl的浓度分别为100，200mM。