[发明专利]HRM技术检测NOD1基因单核苷酸多态性的方法

说明书

本发明涉及检测幽门螺杆菌(H.pylori)感染相关疾病患者体内NOD1基因单核苷酸多态性位点rs2075820，包括利用HRM技术检测NOD1基因单核苷酸多态性的扩增引物和检测方法。本发明操作简便、检测速度快、通量高、费用低、灵敏度和特异度高、重复性好且结果便于判读。有助于临床上幽门螺杆菌(H.p ylori)感染相关疾病的早期发现、早期诊断及早期治疗，对于及时干预治疗避免病情进展、调整治疗方案、预测预后、预防临床复发都具有重要意义。

技术领域

本专利涉及一种临床检验用途的基因多态性检测方法，采用HRM技术，用于检测Hp感染患者体内NOD1基因的SNP位点rs2075820，同时对高危人群进行较为准确的筛查。该方法可有效的节约检测时间和检测成本，提高检测精确度。

技术背景

胃癌是世界范围内常见的恶性肿瘤之一，占各类恶性肿瘤发病率中的第四位，在恶性肿瘤致死原因中仅次于肺癌位居第二位。世界卫生组织(WHO)调查报道2010年全球新增110万胃癌患者，其中60％病例发生在发展中国家。中国是胃癌高发国家，胃癌的发病率和死亡率在恶性肿瘤中均为第三位。研究发现胃癌的发生与幽门螺杆菌(Helicobacterpylori，H.pylori)感染，在宿主体内引发病变过程密切相关。1994年世界卫生组织国际癌症研究中心(IARC)将H.pylori定为I类致癌因子，认为它是胃癌发生的启动和促进因子。流行病学调查显示，全球H.pylori感染率可达50％以上，尤其是在发展中国家其感染率更高，在我国估计其感染率多达6亿以上。H.pylori感染被证明与多种消化系统疾病相关，如消化道溃疡、胃炎、胃癌等。胃癌的发生原因目前尚未明确，但越来越多的研究表明：胃癌的发生是遗传和环境因素共同作用的结果。近年来，相关基因的单核苷酸多态性(SNP)与H.pylori感染在消化道疾病的发生过程中的关系备受重视。因此，深入了解H.pylori的致病机制，以及对胃癌病因学的研究在防治胃癌及降低胃癌的发病率中可能发挥重要作用。

固有免疫的特点是通过模式识别受体识别病原微生物的特征性结构。其中，核苷酸结合寡聚化结构域(nucleotide-binding oligomerization domain,NOD)样受体(NODlike receptors,NLRs)家族是近年最新发现的一类胞浆内受体。研究证实，人类NLRs家族约有20多种，其中NOD1广泛表达于成人组织细胞，可以识别革兰氏阴性细菌肽聚糖的胞壁肽，活化转录因子NF-κB，参与固有免疫并诱导炎症反应的发生和细胞凋亡，而这些转录因子在炎症相关的肿瘤发展中起着重要的作用。SNP是近年来发展较快的分子领域，在暴露于相同危险因素条件下，不同人群有着不同的结局。有研究表明NOD1E266K(rs2075820)位点多态性可增加消化性溃疡、胃窦萎缩和肠化生的风险。筛查NOD1基因SNP位点rs2075820有助于早期发现H.pylori感染相关胃肠疾病的高危人群，通过早期干预降低H.pylori感染人群发展为消化性溃疡、胃窦萎缩、肠化生及胃癌的风险。

目前SNP检测常用的技术有限制性片段长度多态性分析(Restriction FragmentLength Polymorphism,RFLP)、等位基因特异性PCR(AS-PCR)及Sanger测序法等。RFLP对设备要求不高，但操作过程复杂，容易产生假阴性错误；AS-PCR对引物设计及PCR反应条件要求较高，容易出现假阳性错误；Sanger测序法尽管结果准确，但是试验过程繁琐，成本较高。HRM是在实时荧光PCR基础上发展起来的一种实时定量新技术，该技术只需在普通PCR体系中加入饱和染料如(EVA Green)，从扩增到结果分析均在PCR反应管封闭状态下进行，可避免PCR产物污染而导致的假阳性问题，同时也可提高敏感度，后期的数据分析简单、易懂。相较于其他检测方法具有特异度好，灵敏度高，线性关系好，操作简单，自动化程度高、防污染及成本低等优势。因此本发明将HRM法应用于NOD1基因SNP位点rs2075820检测。

发明内容