[发明专利]DNA聚合酶以及核酸检测方法和试剂盒

说明书

本发明提供了以DNA或RNA为模板的DNA聚合酶，其为通过对大肠杆菌聚合酶I的Klenow大片段进行如下氨基酸置换而获得：G198W、V222I，E306K、Q354E、A381E、和E582K。本发明还提供了用于恒温核酸扩增的具有茎环结构的引物。本发明还提供了将快速恒温核酸扩增与Cas检测体系相结合的核酸检测技术和检测试剂盒。它们可用于恒温情况下检测样品中的靶核酸，具有成本低、检测时间短、操作简便、特异性高、灵敏度高等优点，尤其适用于POCT应用。

技术领域

本发明涉及核酸检测技术，尤其是将恒温核酸扩增和Cas检测相结合的核酸检测技术。

背景技术

核酸检测技术具有极大的分子诊断、生化分析、疾病诊断应用价值，例如，用于病毒、细菌、病原体核酸检测以及核酸类疾病标记物的检测，等等。PCR(聚合酶链式反应，polymerase chain reaction)技术是目前应用最为广泛的核酸检测技术。该技术由Dr.Mullis于1983年发明，其主要分为三个基本步骤，即：变性、退火和延伸。PCR技术需要通过反复升降温来实现核酸扩增，对仪器和操作环境要求较高，仪器精密复杂、价格昂贵，且操作繁琐，需要专业技术人员和实验室，因此PCR技术应用范围具有较大的局限性，例如限制了其在即时检测(Point-of-care testing，POCT)等领域的应用。由此以RPA(recombinase polymerase amplification)、RAA(recombinase-aid amplification)、LAMP(loop—mediated isothermal amplification)等为代表的核酸恒温扩增技术越来越得到人们的关注，然而这些技术的特异性不是特别高，容易在实践过程中出现非特异扩增，干扰结果的判读。

另外，长期以来，对RNA的检测依赖于逆转录酶，需要首先由逆转录酶将RNA反转录为cDNA，随后再进行DNA序列的扩增(例如PCR等)。Gulati等人发现，DNA聚合酶I能够依赖寡核苷酸oligo-dT对病毒RNA进行反转录。然而，这种反转录体系对DNA聚合酶：RNA模板比例要求高，逆转录扩增效率不理想(Proc.Nat.Acad.Sci USA Vol.71,No.4,pp.1035-1039,1974)。

发明内容

为了克服上述问题，在一方面，本发明提供了一种以DNA或RNA为模板的DNA聚合酶，其为通过对大肠杆菌聚合酶I的Klenow大片段进行如下氨基酸置换而获得：G198W、V222I，E306K、Q354E、A381E、和E582K。

在一些实施方案中，所述DNA聚合酶具有如SEQ ID NO：18所示的氨基酸序列。

相应地，本发明还提供了编码所述DNA聚合酶的多核苷酸序列或其互补序列。

另一方面，本发明提供了一种用于核酸恒温扩增的DNA引物对，其中所述DNA引物对中的任一个引物或者二者具有茎环结构。

在一些实施方案中，所述茎环结构是通过在与模板序列互补的线性DNA引物5’端添加2至15个碱基而形成，所述2至15个碱基与所述线性DNA引物的3’末端序列互补或者与距所述所述线性DNA引物的3’末端1至10个碱基的序列互补。

在一些实施方案中，所述DNA引物对中的任一个引物或者二者的长度为33至45个碱基；或者在所述线性引物的5’端还添加有T7启动子序列，则所述DNA引物对中的任一个引物或者二者的长度为51至63个碱基。

另一方面，本发明提供了一种在样品中确定靶核酸的水平的方法，包括：

1)从所述样品中分离所述靶核酸；

2)以分离的所述靶核酸为模板，采用恒温核酸扩增技术进行扩增，获得DNA扩增产物；以及

3)采用Cas检测组合物检测所述DNA扩增产物的量，并将所述DNA扩增产物的量与所述样品中所述靶核酸的水平相关联。