[发明专利]基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记方法

说明书

本发明提供了一种基于马来酰亚胺衍生物的非同位素双标记绝对定量检测方法和相对定量检测方法，以两种结构类似的N取代马来酰亚胺衍生物分别作为非同位素标记试剂对巯基进行特异性标记，然后以质谱信号强度比以及样品浓度或浓度比作为坐标，得到标准曲线，进而对目标分析物进行定量分析。本发明选用的非同位素标记试剂成本低廉，反应迅速，标记效率高，反应条件简单温和快速，可对不同序列多肽进行质谱定量分析，并可同时实现绝对与相对定量。同时适用面广，只要含有巯基的大分子化合物都能适用，可同时检测多个目标分析物。该技术可用于测定纳米材料表面吸附的蛋白含量，定量检测含半胱氨酸的多肽类疾病标志物，分析含巯基多肽类药物代谢情况等。

技术领域

本发明涉及大分子质谱技术领域，尤其涉及一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记方法。

背景技术

大分子质谱是一种高通量分析技术，在快速分析生物大分子(核酸，蛋白质，多肽等)领域取得了很大的成功，因此成为蛋白质组学中最常用的分析手段。但是，质谱信号的强度严重依赖于样品的结晶情况，即使在同一样品点的不同区域，其信号强度也存在很大差异，降低了信号的重现性，因此无法实现定量分析的目的，严重阻碍了质谱技术在蛋白质组学分析中的应用。

同位素标记内标定量法已经作为合适的质谱定量技术成功应用在蛋白质组学分析中，并已有商业化产品面世。其中包括在细胞培养液中稳定的同位素标记(SILAC)，用于相对和绝对定量的同位素标签(iTRAQ)以及同位素编码亲和标签(ICAT)等。它们通过内标的引入能克服结晶不均一导致的信号不均一的缺点，实现质谱定量分析检测多肽和蛋白质。尽管同位素内标定量法具有很高的精确度，且能实现高通量分析，但是依然存在许多不足之处。如SILAC技术依赖于细胞培养过程中进行标记，iTRAQ依赖于二级质谱分析差异，且这些定量方法适用于大规模组学分析，对单一或者少量分析物来说性价比不高。ICAT试剂分子量过大，标记效率偏低。此外同位素试剂的高昂成本也限制了其在蛋白质组学中的广泛使用。

发明内容

有鉴于此，本发明要解决的技术问题在于提供一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记方法(DuMalTagging技术)，非同位素标记试剂成本低，效率高，可对不同序列多肽进行质谱定量分析，并可以同时实现绝对与相对定量的质谱定量分析。

为解决以上技术问题，本发明提供了一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记绝对定量检测方法，包括以下步骤：

A)采用第一标记试剂标记目标分析物标准品，记为内标；

B)采用第二标记试剂标记目标分析物标准品，并配置成具有浓度梯度的标准品组；

C)将步骤A)得到的内标分别与步骤B)得到的具有浓度梯度的标准品组等体积混合，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测；

D)以质谱信号强度比为纵坐标，步骤B)得到的标准品组的浓度为横坐标作图，得标准曲线；

E)采用第二标记试剂标记目标分析物，与步骤A)得到的内标等体积混合，进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪，根据步骤D)得到的标准曲线得到目标分析物浓度；

所述第一标记试剂和第二标记试剂独立的选自N-甲基马来酰亚胺或N-乙基马来酰亚胺；或者选自N-乙基马来酰亚胺或N-(2-羟乙基)马来酰亚胺；或者选自N-苯基马来酰亚胺或N-苄基马来酰亚胺；且第一标记试剂和第二标记试剂不同；

所述目标分析物为具有还原态巯基的大分子化合物。

本发明提供了一种基于马来酰亚胺衍生物组合的非同位素双标记相对定量检测方法，包括以下步骤：

a)将两组样品分别用第一标记试剂和第二标记试剂标记后，以不同浓度比混合进行基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱仪检测；

b)以质谱信号强度比为纵坐标，样品浓度比为横坐标，得到标准曲线；