[发明专利]猪PLIN1基因的克隆引物、单核苷酸多态性位点检测方法及应用

说明书

本发明属于分子生物学技术领域，提供了猪PLIN1基因克隆引物、单核苷酸多态性位点检测方法及应用，公开了克隆猪PLIN1基因的两对引物，并以猪基因组DNA为模板，利用引物进行PCR扩增，对PCR扩增产物进行回收、检测后进行混池测序，将猪PLIN1基因测序结果与公布的目标序列对比，确认是目标序列后与其他不同品种猪的DNA进行比对，判定多态性位点。本发明采用PCR的方法，成功的克隆了猪PLIN1基因的序列，进行单核苷酸多态性位点的检测，并用于品种的鉴定。

技术领域

本发明属于分子生物学技术领域，具体涉及猪PLIN1基因的克隆引物、单核苷酸多态性位点检测方法及应用。

背景技术

中国自古以来都是养猪生产和猪肉消费的大国，猪肉在人们的日常生活中占据了及其重要的地位。人们不仅有很大的猪肉需求量，随着时代的不断发展，人们的消费水平和生活质量日益增长，对猪肉品质的要求也是愈来愈高。现如今，猪的育种方向在全世界都经历了高脂型猪肉向瘦肉型猪培育的转变，除了提高猪的繁殖性能、生长速度、肉的产量等，如何在猪育种方向和生产实践中，在“肉质量”和“肉产量”中取得平衡是当前生产优质猪领域的热点关注问题。猪是脂肪沉积型动物，脂肪含量是评定猪肉品质的重要指标，脂肪的分布与含量高低直接影响猪肉品质的优劣，肌内脂肪含量是猪肉品质的一个主要的决定因子，它与肉的嫩度、风味和多汁性等食用品质有极其密切的关联。通过改善肌内脂肪含量来改善猪肉品质，是目前猪肉质改良的主要方向之一。PLIN1基因与脂类代谢关系密切，它对脂肪中甘油三酯的代谢具有双向调控作用，它的磷酸化可促进甘油三酯水解，从而动员脂肪分解。

脂滴包被蛋白(perilipin,PLIN)是脂滴相关蛋白家族的核心成员之一。在20 世纪80年代晚期在大鼠附睾脂肪细胞的脂帽部分发现的一种可磷酸化蛋白，包被于脂滴外周表面。脂滴包被蛋白是定位于脂滴表面的高磷酸化的蛋白，被脂肪细胞和类固醇生成细胞内包裹。PLIN对脂肪中甘油三酯的代谢具有双向调控作用，它的磷酸化可促进甘油三酯水解，从而动员脂肪分解，同时也可通过阻止脂肪酶接近脂滴，降低基础状态下的脂解，因此被称为脂肪分解调控中的“分子开关”。脂滴包被蛋白合成于游离核糖体，由PLIN基因编码，其中人的PLIN基因定位于15q26，鼠的则定位于第7号染色体，根据结构可将其分为A、B、C、D共4种亚型，其中A含量最多，分子量为57kDa，在脂肪细胞和类固醇生成细胞中均有表达；B的分子量为46kDa，在两种细胞中有少量表达，C和D仅表达于类固醇生成细胞。随着脂肪分化成熟，PLIN在脂滴表面逐渐增加，包被相对成熟、体积较大的脂滴形成一道分子屏障，阻挡脂肪酶接触脂滴因而抑制脂肪分解。而当PLIN被蛋白激酶A(protein kinase A,PKA)磷酸化，该屏障被修饰而发生变化，从而使得脂肪酶接触并分解甘油三酯，因此PLIN磷酸化是控制脂肪分解反应的限速步骤。Brasaemle等报道，PLIN过表达使甘油三酯脂分解下降，导致甘油三酯(Triglyceride,TG)水平与对照组相比升高了6～30倍，另有研究表明这也可促使胆固醇的聚集，从而提高胆固醇的贮存量，可见其在胆固醇的代谢中的重要作用，故推测其在动脉粥硬化的发生中可能发挥重要的作用。诸多研究表明，PLIN蛋白在脂类代谢过程中扮演重要角色。PLIN1基因多态性对脂肪沉积有一定的影响。对外来猪PLIN1基因的研究表明，PLIN1基因多态性与猪的平均日增重、瘦肉率和背膘厚关联密切。