[发明专利]紫花玉簪内生真菌菌丝体醇提物的抗氧化活性及其应用

说明书

本发明涉及紫花玉簪内生真菌（HoV1，HoV4，HoV8）及其分离培养方法和其醇提物的抗氧化作用。该真菌分离自紫花玉簪，具有较高的总抗氧化活性和较强的DPPH自由基和ABTS⁺自由基清除能力。

技术领域

本发明属微生物技术领域，特别是涉及3种紫花玉簪内生真菌醇提物的制备及其应用。

背景技术

紫花玉簪（Hosta ventricosa）属百合科（Liliacea）玉簪属（Hosta）多年生宿根草本植物，主要分布于海拔500～2400 m的亚洲温带，亚热带地区，原产于中国，韩国和日本。其全草均可入药，是一种蒙医药学传统常用药材，其中玉簪花主治疔疮，蛇虫伤等，玉簪叶主治咽喉疼痛，小便不适，烧伤等，玉簪根消除肿痛、解除毒素等。人类多种心血管疾病均与氧自由基有关，然而合成抗氧化剂均存在一定的毒性，从天然产物中寻找高效、低度抗氧化剂已成为一个必然趋势。据相关报道，蒙药玉簪具有抗氧化作用、能改善抗氧化酶在机体中的活力等。申请者根据宿主植物与其内微生物在长期共同生活而具有产生相同活相似次生代谢产物合成途径的“内共生理论”，从紫花玉簪中分离筛选到具有较强抗氧活性的内生真菌，相关研究未见报道。

发明内容

本发明的目的是从紫花玉簪中分离筛选出提取物有抗氧化活性的内生真菌，并将该提取物应用于抗氧化药物。

本发明的目的通过以下技术方案实现：

紫花玉簪内生真菌醇提物的抗氧化活性及其应用，所述提取物通过以下制备方法制得：

（1）采集新鲜健康紫花玉簪根部；

（2）将步骤（1）紫花玉簪根部组织表面消毒后，做超净工作台洁净度检查，漂洗液检查，植物组织印记法筛选无菌组织块；

（3）将步骤（2）的无菌组织于无菌工作台切成小块，置于PDA培养基中，于恒温真菌培养箱中倒置培养，待出现内生真菌菌丝沿组织切口向外生长时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经反复纯化后转接到PDA斜面培养基，备用；

（4）将新鲜马铃薯洗净去皮后切成小块，加蒸馏水煮沸，用纱布过滤，滤液中加入葡萄糖搅拌均匀，用蒸馏水稀释、分装、灭菌，制得液体发酵培养基；

（5）将步骤（4）液体发酵培养基分装在锥形瓶中，用打孔器将经步骤（3）分离纯化的内生真菌打入菌饼于锥形瓶中，恒温培养、烘干后碾碎，将菌丝体进行乙醇超声提取，提取液浓缩干燥，即得提取物。

具体实施方式包括以下步骤：

（1）紫花玉簪组织的准备：采集新鲜健康紫花玉簪根部；

（2）紫花玉簪组织的表面消毒与无菌检测：将步骤（1）紫花玉簪根部组织表面消毒后，做超净工作台洁净度检查，漂洗液检查，植物组织印记法筛选无菌组织块；

（3）紫花玉簪内生真菌的分离培养：将步骤（2）的无菌组织于无菌工作台切成直径为0.5 cm左右的小块，置于PDA培养基中，于25 ℃恒温真菌培养箱中倒置培养，待出现内生真菌菌丝沿组织切口向外生长时，采用尖端菌丝挑取法，挑取形态不同的菌落，经反复纯化后转接到PDA斜面培养基，备用；

（4）内生真菌液体发酵培养基的配置：将新鲜马铃薯洗净去皮后切成小块，称取200 g，加蒸馏水1000 mL煮沸30 min，用4层纱布过滤，滤液中加入葡萄糖（20 g）搅拌均匀，用蒸馏水补足1000 mL，分装至250 mL锥形瓶中装量100 mL，121 ℃条件下灭菌30分钟；