[发明专利]一种人脂肪干细胞用的细胞冻存液

说明书

本发明提供了一种人脂肪干细胞冻存液及其制备方法。该细胞冻存液包括低密度脂蛋白，海藻糖，甘油，卵磷脂，多肽，bFGF，维生素E，还原性谷胱甘肽。本发明提供的细胞冻存液用于冻存人脂肪干细胞，特别是提高了冻存细胞复苏后的存活率。具有较好的应用前景。

本发明是申请号为“201710643072.1”、发明名称为“一种人脂肪干细胞用的细胞冻存液”发明专利的分案申请。

技术领域

本发明涉及组织细胞培养技术领域，具体涉及一种人脂肪干细胞冻存液及其制备方法和应用。

背景技术

脂肪干细胞(Adipose-derived stem cells，ADSCs)是近年来从脂肪组织中分离得到的一种具有多向分化潜能的干细胞，具有可迅速扩增、不易衰老等一般干细胞的特点。人脂肪干细胞即人体脂肪间充质干细胞是目前广泛应用于组织工程及再生医学领域的一种成体干细胞与骨髓间充质干细胞一样具有多向分化潜能。ADSCs呈成纤维细胞样生长，胞浆和核仁丰富，呈平行或漩涡样排列。细胞周期分析显示G0/G1期的细胞占69％，S期占24％，G2/M期占8％。在胎牛血清的存在条件下传代培养2-3天细胞增殖I倍。多次传代(10-20代)后，细胞增殖速度无明显减慢，在传代6次后细胞群体中出现衰老细胞，第15代细胞群体中衰老细胞约占15％。

由于人脂肪间充质干细胞分离培养周期较长，原代细胞铺满的时间约2周以上，达到一定的数量需要3周左右。人脂肪间充质干细胞体外长期培养传代容易发生自发分化，失去其多向分化的潜能。所以为保证实验的连续性，必须随时提供大量的实验或组织工程用的种子细胞。因此，对于细胞的需求非常强烈。现在，将生产好的细胞进行冷冻保存，使用时再几种解冻使用也是常规的使用模式。然而现有技术中干细胞冻存使用的冻存液有含血清和无血清的两类，由于血清具有成分复杂、质量不稳定、价格昂贵等缺点，无血清冻存和复苏技术成为发展趋势。低温保存干细胞主要依靠抗冻液二甲基亚砜(DMSO)和血清的保护。常用到的细胞保护剂还有羟乙基淀粉0ES)、聚乙二醇(PEG)等。但是，DMSO会对细胞产生毒性作用，对冻存的干细胞造成不可逆的损伤。为获得来源方便的神经干细胞，开展有效的神经干细胞冻存方法是本领域迫切的需求，建立一种长期低温保存人脂肪干细胞的方法对于促进人脂肪干细胞的研宄和应用具有重大意义。

发明内容

本发明要解决的技术问题是提供一种人脂肪干细胞冷冻保存液以及相应的制备方法及使用方法。

红果黄肉楠是一种小乔木，申请人经过研究发现，该植物中具有能够耐寒冷的物质存在，因此，申请人通过高通量筛选获得了相应的具有耐寒的多肽，因此，申请人尝试将其加入到冷冻保存液中，用于保存细胞。

本发明的技术方案如下：

一种人脂肪干细胞冷冻保存液，其特征在于由如下各组分组成：其特征是冷冻存液中含有:0.5％w/v低密度脂蛋白，1％w/v的海藻糖，1％甘油，1％w/v卵磷脂，多肽0.1％w/v，bFGF 1％w/v，维生素E 1％w/v，还原性谷胱甘肽0.5％w/v最后用DMEM培养基定容至100ml，所述多肽的序列如SEQ ID NO：1-32任一所示。所述多肽有申请人通过前期的大量的基因库筛选得到，所述多肽具有保护细胞免受损伤的功能。其名称分别为KATS-1、KATS-2、KATS-3、KATS-4、KATS-5、KATS-6、KATS-7、KATS-8、KATS-9、KATS-10、KATS-11、KATS-12、KATS-13、KATS-14、KATS-15、KATS-16、KATS-17、KATS-18、KATS-19、KATS-20、KATS-21、KATS-22、KATS-23、KATS-24、KATS-25、KATS-26、KATS-27、KATS-28、KATS-29、KATS-30、KATS-31、KATS-32，其依次对应于SEQ ID NO：1-32。

在本发明的细胞的冻存液中，海藻糖以及维生素E和多肽具有明确的抵御外来伤害对细胞的损伤，特别是多肽，还具有保护细胞免受冻存时冰结晶对细胞的损伤。