[发明专利]PD-L1剪接体c作为预测肿瘤预后靶标的应用

说明书

本发明在正常和突变型的结直肠癌细胞系中观察到PD‑L1的三个不同的可变剪接体的表达，通过构建三个剪接体的真核表达载体，转染不表达或低表达PD‑L1的肿瘤细胞中，发现isoform c促进了肿瘤细胞的增殖、迁移以及侵袭，提示isoform c促进肿瘤的发生发展，是潜在的肿瘤诊断和治疗靶点以及肿瘤不良预后的监测靶点；同时，本发明还发现isoform b过表达的肿瘤细胞系与免疫细胞共培养时，促进了免疫细胞的凋亡，抑制了免疫细胞细胞因子的分泌，提示其具有抑制患者体内免疫反应，是肿瘤不良预后的监测靶点。

技术领域

本发明涉及一种PD-L1剪接体在指导肿瘤免疫治疗用药中的应用，属于生物医药领域，具体为肿瘤的免疫治疗领域。

背景技术

近年来，抗程序性死亡生长因子-1(programmed death-1，PD-1/CD279)/程序性死亡配体-1(programmed death ligand-1，PD-L1/CD274)通路的免疫检查点阻断剂是抗肿瘤治疗的研究热点。目前已有Atezolizumab、nivolumab、pembrolizumab等试剂应用于黑色素瘤、非小细胞肺癌、结直肠癌(colorectal cancer，CRC)等恶性肿瘤的临床试验，并且取得了一定的治疗效果[1]。其中，结直肠癌为世界第三大高发癌症，且其致死率居恶性肿瘤第四位，对其适用的诊疗研究迫在眉睫。

PD-L1作为潜在的CRC诊疗指标，已有较多研究对其蛋白表达水平进行检测，以期探究PD-L1与CRC间存在的关联。早在2013年，Shi等就对143例CRC患者样本进行免疫组化(Immunohistochemistry，IHC)检测。结果显示，PD-L1在CRC中呈高表达，且与细胞分化程度及TNM分期有关，甚至可作为判断预后的独立因素[2]。之后，Matthew等对181 例CRC患者IHC样本进行更为细致的分析。研究进一步证实了，PD-L1高表达状态与肿瘤的分期分型及预后相关[3]。同时，大量研究结合CRC患者的PD-L1表达水平与预后情况进行了相关性的统计学分析。Zhu等以结直肠锯齿状腺癌为研究对象，分析了120例IHC样本后发现，PD-L1高表达率为25％，且该部分患者预后较差[4]。而近期的其它研究还表明，肿瘤浸润性淋巴细胞(tumor-infiltrating immune cells，TILs)内的PD-L1表达量越高，患者的无病生存期越短、预后越差[5-7]。与此一致的是，在Roy S等针对抗PD-L1单抗药物 MPDL3280A的研究中，PD-L1在IHC中的表达量(尤其是在TILs中)与患者的疾病缓解率成正比[8]。除此之外，Tony等的研究还证实，错配修复缺失型患者(mismatch repair-deficient，MMR-D)的PD-L1表达量要高于错配修复完善型患者(mismatch repair-proficient，MMR-P)，这将有助于筛选出可进行免疫治疗的适用患者[9]。不仅如此， PD-L1表达量还与CRC肿瘤微环境中的调节性T细胞数量[10]、肿瘤的各项病理参数及基因突变情况等相关[11]。总体而言，对PD-L1蛋白水平进行及时和准确的检测对指导CRC 患者的治疗非常有利。

现有技术中已经公开了PD-L1存在三个可变剪接体(isoform)，即Isoform a，Isoform b， Isoform c，但是仅仅公开了三个剪接体的存在，未曾有研究表明三个剪接体在体内的作用及其机理，也未有研究表明其在一种具体癌症中的作用。本发明的技术方案首次在肿瘤细胞中发现了PD-L1可变剪接体的作用，以及讲所述的作用机理应用与肿瘤免疫治疗的用药。

发明内容

本发明的一个方面，是发现了在结直肠癌细胞系中差异表达的PD-L1。在一个具体的实施例中，所述的结直肠癌细胞系是RKO，差异表达的PD-L1的细胞系中是RKO-MUT(由浙江大学医学院病理学与病理生理学实验室保存，承诺向公众20年内免费提供)。在另外一个具体的实施例中，所述的差异表达是指采用RNAi干扰后，PD-L1在RKO-MUT细胞系中与RKO细胞系中的分子量差异，具体如图2所示。