[发明专利]一种草鱼出血症灭活疫苗及其制备方法

权利要求书

1.一种草鱼出血症灭活疫苗，其特征在于，由灭活病毒液和蜂胶佐剂组成，所述灭活病毒液为含草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液。

2.根据权利要求1所述的一种草鱼出血症灭活疫苗，其特征在于，所述草鱼出血症灭活疫苗中蜂胶含量为10mg/mL。

3.权利要求1或2中所述草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：将蜂胶佐剂加入草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液中，边加边震摇，使蜂胶与灭活病毒液充分混合成灭活疫苗，最终蜂胶含量为10mg/mL。

4.根据权利要求3所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液的制备方法包括以下步骤：

(1)草鱼吻端成纤维种子细胞培养：从液氮中取出草鱼吻端成纤维种子细胞，采用容量为250ml的细胞培养瓶，加入细胞培养液静止培养，细胞浓度为1×10⁵～2×10⁵个细胞/ml，细胞培养温度为28±1℃，培养3～4天即可长成致密单层；

(2)制苗用细胞制备：从液氮中取出草鱼吻端成纤维种子细胞，采用15L大细胞瓶增殖传代，加入细胞培养液，细胞接种浓度为1.5×10⁵～2.0×10⁵个细胞/ml，将15L大细胞瓶置于转瓶机上旋转培养，转速12转/小时，28℃下2～3天长成单层细胞；

(3)生产用毒种制备：将步骤(1)中的长成单层致密细胞的细胞培养瓶倒掉细胞培养液，按病毒:细胞＝1:100的质量浓度接种冻干GCHV-892毒种，置28℃恒温吸附1小时后，倒掉病毒液，加入细胞维持液，置28℃恒温培养，培养5～6天，细胞病变程度达75％以上，每毫升病毒毒价≥10^8.7TCID₅₀时，即得到细胞病毒培养液，保存于-70℃备用；

(4)制苗用病毒液的制备：按步骤(2)的方法培养草鱼吻端成纤维细胞，待其长成单层后，倒掉细胞培养液，换以步骤(3)中制备得到的细胞病毒培养液和细胞维持液，细胞病毒培养液与细胞维持液的体积比为1：50，置于28±1℃下恒温培养，培养5～6天后，当病变细胞达75％以上，每毫升病毒毒价≥10^8.7TCID₅₀时，即可收获制苗用病毒液，置于-20℃保存；

(5)灭活及稀释：将步骤(3)所得制苗用病毒液冻融混合，加入体积比为0.1％的甲醛，置35℃恒温72小时灭活病毒，用0.65wt.％灭菌生理盐水稀释100倍，制备得到草鱼出血症病毒GCHV-892的灭活病毒液。

5.根据权利要求4所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述细胞培养液由199培养基配制而成，加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存，使用时加入10wt.％犊牛血清，再用NaHCO₃调pH至7.0～7.2。

6.根据权利要求4所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述细胞维持液由199培养基配制而成，加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存，使用时加入2wt.％犊牛血清，再用NaHCO₃调pH至7.2～7.5。

7.根据权利要求4所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述细胞消化液由胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠混合配制而成：用无钙镁磷酸缓冲液配制胰蛋白酶和乙二胺四乙酸二钠混合溶液，使其胰蛋白酶浓度为0.25wt.％，乙二胺四乙酸二钠浓度为0.02wt.％，加入青霉素钾和硫酸链霉素使其浓度分别为100IU/ml和100μg/ml，采用不锈钢圆筒式过滤器装入孔径0.2μm的滤膜正压过滤除菌，-20℃保存。

8.根据权利要求3所述的一种草鱼出血症灭活疫苗的制备方法，其特征在于，所述蜂胶佐剂的制备方法为：将蜂胶在4-8℃下粉碎、过筛，按质量体积比为1:4g/ml的比例加入95wt.％的乙醇，放室温浸泡24-48小时，冷却，过滤取上清液。