[发明专利]一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法

权利要求书

1.一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

（1）利用无血清培养基进行人间充质干细胞的培养，取上清液；

（2）对步骤（1）得到的上清液进行超滤法处理后，获得所需要的外泌体；

（3）利用乳酸钠林格注射液对步骤（2）得到的外泌体进行重悬处理，得到外泌体悬液；

（4）在步骤（3）得到的外泌体悬液中按质量比例加入氯化钠（0.1-2%）、氯化钾（0.1-1%）、乳酸钠（0.1-1%）、氯化钙（0.1-1%）、葡萄糖（0.05-5%）、必须氨基酸（0.01-5%）、非必须氨基酸（0.01-5%）、人血清白蛋白（0.1-10%），即为所制备的外泌体生物制剂。

2.如权利要求1所述的一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述上清液进行超滤法处理,具体包括如下步骤:

a、将收集到的上清液分装于50mL的离心管中，在4℃ ,300g离心10min，除去残余细胞；2000g离心20min，除去细胞碎片；收集上清液并用0.22μm孔径的过滤器进行过滤；

b、将步骤（1）收集到的上清液加入装有超滤膜的旋转超滤仪中，接通氮气并将最大进气压力控制在517.125kPa以下，打开磁力搅拌器；待上清液超滤完毕后，加入200-500mL 生理盐水并再次超滤，重复3-5次。

3.如权利要求1所述的一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述步骤（3）得到的外泌体悬液，需进行蛋白浓度的检测后，再添加步骤（4）所述的物质。

4.如权利要求1所述的一种人间充质干细胞源外泌体的生物制剂的制备方法，其特征在于，所述生物制剂的具体制备方法是:

1)将人间充质干细胞利用含10%FBS（GIBCO）的alpha-MEM液体培养基进行悬浮为细胞悬液，并调整细胞浓度为1×106/ml-2×106/ml；

2)按照3E7/细胞工厂进行接种，培养至细胞融合度至70%-80%，细胞处于增殖的最佳时机，培养时间为2-3天；

3)将细胞工厂中液体倾倒，并用alpha-MEM液体培养基对细胞工厂进行洗涤，在这个过程中使用alpha-MEM液体培养基进行洗涤一方面将细胞工厂中残余的FBS清除；

4)在细胞工厂中加入1250ml的alpha-MEM液体培养基；

5)在37℃，5%的CO2条件下培养96小时，收集得到MSC培养液；

6)取5）中收集的上清液，进行离心处理（300-1000g/min，5min),去除细胞碎片，收集上清液弃去沉淀；

7）将6）中收集的上清液进行二次离心（1000g-2000g/min,15min)；去除凋亡小体，收集上清液，弃去沉淀；

8）将7）中收集的上清液利用旋转超滤仪进行超滤处理，以收集培养液中分泌的外泌体；

9） 利用乳酸钠林格注射液洗涤超滤膜上的外泌体，洗涤三次，将洗涤液混合后利用BCA试剂盒进行蛋白定量；

10）根据9）中蛋白定量的结果计算浓度后，按质量比例添加葡萄糖，人血清白蛋白，氨基酸，非必需氨基酸，后置于磁力搅拌器进行搅拌20min，从而使外泌体均匀分散于保存液中后，并置于-20度保存。