[发明专利]基于多形汉逊酵母的白桦脂酸生物合成途径筛选方法

说明书

本发明提供一种基于多形汉逊酵母的白桦脂酸生物合成途径筛选方法，主要是运用低能离子注入介导白桦树基因组DNA转化酵母菌，为利用“逆向思维”高效解析白桦脂酸生物合成途径提供了材料，为解决白桦脂酸来源短缺、保护落叶类乔木植物白桦树资源及其可持续发展提供新途径。

技术领域

本发明属于超远缘遗传转化技术领域，具体涉及利用离子注入介导白桦树基因组DNA在酵母菌中的遗传转化。

背景技术

白桦脂酸(betulinic acid，BA)为五环三萜酸化合物，存在于白桦树(Betulapubescens)、桃金娘科赤楠(Syzygium formosanum)、滇刺枣(Ziziphus mauritiana)等植物中。近年来的研究表明，BA具有许多药理活性，如抗肿瘤、抗炎、抗菌、抗HIV、抗疟疾等，特别在抗肿瘤方面，如针对黑色素瘤，表现突出。因BA具有众多的药理活性，加之其较高的安全性，美国癌症研究所已将开发白桦脂酸列入快速研发规划项目，使得BA备受关注。

目前BA主要是从白桦树皮中提取，但BA在白桦树中含量很低，提取工艺复杂，纯化困难。因此，从植物中提取BA目前还没有潜在的工业化价值，其往往作为提取白桦脂醇的一种副产品。因此，迫切需要寻求及扩大白桦脂酸新药源途经以满足临床上对其日益增长的需求。

分离天然产物生物合成基因，并借助转基因酵母细胞工厂进行发酵，已经成为大量而经济地合成植物天然产物的有效途径。然而萜类化合物在植物体内不仅拥有复杂的合成途径，且同一途径中某一关键限速酶有若干个同工酶，加上部分关键代谢酶基因处于低表达水平，很难利用传统分子生物学方法快速解析较佳的天然产物生物合成途径。例如，章焰生课题组利用白桦脂酸合成的关键细胞色素氧化酶基因(BPLO基因)，在微生物酵母细胞中人工重建了白桦脂酸生物合成途径，构建的酵母工程菌利用常用培养基即能合成植物来源化合物白桦脂酸，但产量仅为0.16mg/L。

尽管Lü等通过Ar⁺和N⁺注入介导麻黄基因组DNA转化酵母，获得遗传稳定的酵母工程菌，麻黄碱和伪麻黄碱产量分别为18.85mg/L和4.11mg/L。同时，Jin等利用低能离子注入介导甘草基因组DNA转化酵母，获得了遗传稳定的酵母工程菌，其五环三萜苷类物质甘草酸的最高产量达114.49mg/L。但是，在利用低能离子注入介导的超远缘遗传转化改造酵母生物合成白桦脂酸的方面，国内外目前尚未见报道。

发明内容

本发明的目的在于提供一种基于多形汉逊酵母的白桦脂酸生物合成途径筛选方法。

为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案：

1)运用低能离子注入介导白桦树基因组DNA转化多形汉逊酵母出发菌株；

2)将经过步骤1)处理后的出发菌株涂布于YPD固体培养基进行培养，挑取经YPD固体培养基培养所得的菌落于YPD液体培养基中进行发酵，发酵后离心提取发酵液，采用薄层层析对发酵液进行白桦脂酸定性分析；

3)挑取发酵液中存在白桦脂酸的对应菌落于YPD液体培养基中进行发酵，利用高效液相色谱对发酵所得发酵液进行白桦脂酸定量分析。

所述出发菌株为多形汉逊酵母H.polymorpha DL-1(来源为ATCC No.26012)。

所述低能离子束注入的条件为：注入离子为N⁺，注入剂量为1.5×10¹⁶～2.5×10¹⁶ions/cm²，注入能量为15～25KeV，脉冲时间为5～10s，间隔时间为5～10s，真空度为1.5～2.0×10^-3Pa。

所述发酵包括以下步骤：于37℃、转速为200r/min条件下培养60～96h。

所述发酵的过程中流加0.5％的葡萄糖水溶液，流速为12.5mL/h。