[发明专利]一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条及制备方法

说明书

本发明公开了一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条及制备方法，该弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条包括：吸水垫、硝酸纤维素膜、纳米胶体碳释放垫、样品垫、PVC胶板；该弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条的制备方法包括：弓形虫抗原ESA的制备、兔抗ESA血清的制备、纯化兔抗ESA抗体、确定纳米胶体碳ESA溶液的最佳PH值及ESA的用量、纳米胶体碳母液的制备、纳米胶体碳溶液最佳稀释倍数的确定、试纸条的组装，本研究建立的弓形虫病胶体碳诊断试纸条灵敏度和特异性较好，具有操作简单、快速，检测条带清晰，相对于传统的胶体金诊断试纸条制作成本极大降低的优点，适用于临床弓形虫病的快速诊断。

技术领域

本发明属于弓形虫病检测技术领域，涉及一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条及制备方法。

背景技术

弓形虫可以感染几乎所有的温血动物，给养殖业带来重大的经济损失，同时感染弓形虫的孕妇会导致流产、胎儿畸形、先天性缺陷或死胎。目前弓形虫病的血清学诊断方法主要有改良凝集实验(MAT)、间接血凝实验(IHA)、间接免疫荧光实验(IFA)、酶联免疫吸附实验(ELISA)等，但是这些方法有的需要具有专业知识的技术人员在实验室条件下才能操作完成，费时费力；有的制作成本较高不利于大面积推广。纳米胶体碳克服了上述缺陷，可以有效的作为快速诊断试纸条的标记物质，且成本非常低。弓形虫排泄分泌抗原(ESA)主要包括微线体蛋白(MIC)、棒状体蛋白(ROP)及致密颗粒蛋白，具有很好的免疫原性和反应原性。基于纳米碳颗粒作为标记物而出现的纳米胶体碳试纸条相对传统的金标胶体试纸条检测背景更为清晰，且纳米碳颗粒的成本是金标颗粒的万分之一，这极大的降低了试纸条研制的成本，目前基于该标记物而研制的试纸条已成功应用于日本血吸虫和疟原虫的检测。本研究采用纳米碳做显色标记物，弓形虫ESA作为检测物，旨在研制一种快速，灵敏的弓形虫病诊断试纸条。

发明内容

为实现上述目的，本发明提供一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条及制备方法，解决了现有技术中存在的问题。

本发明所采用的技术方案是：一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条包括质控线1、检测线2、吸水垫3、硝酸纤维素膜4、纳米胶体碳释放垫5、样品垫6、PVC胶板7，其特征在于，所述质控线1是将抗ESA IgG喷于硝酸纤维素膜4形成，所述检测线2是将纯化ESA喷于硝酸纤维素膜4形成，检测线2和质控线1设置在硝酸纤维素膜4的两侧，硝酸纤维素膜4的上方两端分别为纳米胶体碳释放垫5和吸水垫3，纳米胶体碳释放垫5的上方为样品垫6，所述样品垫6、纳米胶体碳释放垫5、硝酸纤维素膜4、吸水垫3从左至右依次排列并粘贴在PVC胶板7上。

优选的，所述样品垫6为玻璃纤维素膜。

优选的，所述纳米胶体碳释放垫5为胶体碳溶液处理好的聚酯膜。

优选的，所述吸水垫3和硝酸纤维素膜4相接处重叠1.0-1.5mm，纳米胶体碳释放垫5与硝酸纤维素膜4相接处重叠1.0-1.5mm，所述样品垫6与纳米胶体碳释放垫5相接处重叠1.0-1.5mm。

一种弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条的制备方法，其特征在于，该弓形虫纳米胶体碳诊断试纸条的制备方法具体包括以下步骤：

步骤一、弓形虫抗原ESA的制备：

从液氮中保存的弓形虫速殖子，放入到37℃水浴锅中解冻，大约5min融化后，用5mL灭菌生理盐水加入到融化后的1mL弓形虫速殖子保存液中，反复吹打混匀后5000rpm/min离心10min，离心后弃上清液，沉淀再加5mL的灭菌生理盐水充分混匀后以同样的速度离心，反复洗涤2～3次，最后用混有1000U抗生素的溶液洗涤管底，按每只小鼠0.2mL的剂量注入小鼠腹腔中，连续传代3次恢复虫株活性和毒力后，待小鼠发病时，用2mL灭菌生理盐水冲洗感染鼠的腹腔，收集腹腔洗液，3000rpm/min离心30min，收集上清镜检确定没有速殖子和小鼠腹腔细胞后冻于-20℃冰箱过夜，次日取冻存上清室温融化，3000rpm/min离心30min除去自凝物，收集上清即为ESA抗原；