[发明专利]一种酿酒酵母菌株高产乳酸乙酯的新途径及其应用

说明书

本发明属于生物工程技术领域，尤其是一种酿酒酵母菌株高产乳酸乙酯的新途径及其应用。通过将乳酸脱氢酶、丙酰辅酶A转移酶与醇酰基转移酶同时在酿酒酵母中异源表达来实现高产乳酸乙酯。在出发菌株中完全敲除丙酮酸脱羧酶，过表达乳酸脱氢酶，以获得一定L‑乳酸产生能力的酵母菌株；选用强启动子TEF1过表达丙酰辅酶A转移酶及强启动子PGK1过表达醇酰基转移酶，以同宗配合的基因HO作为整合位点，增加一个丙酰辅酶A转移酶的拷贝数，获得乳酸乙酯显著提高的酵母菌株，其乳酸乙酯的产量达353.1mg/L，与出发菌株相比，异戊醇降低49.9％，苯乙醇降低59.2％，满足白酒相关领域对酵母的较高要求，具有广阔的应用前景。

技术领域：

本发明属于生物工程技术领域，涉及工业微生物的育种，尤其是一种酿酒酵母菌株高产乳酸乙酯的新途径及其应用。

背景技术：

酯香物质是白酒中主要的风味物质，较高的酯含量不仅赋予其重要的酯香，同时能有效地扩张、松弛神经，可减少喝酒引起的副作用。乳酸乙酯则是所有香型中国白酒的重要呈香物质，适宜的乳酸乙酯含量对中国白酒的风味质量至关重要。清香型白酒酯类化合物中乳酸乙酯仅次于乙酸乙酯，乳酸乙酯和乙酸乙酯的含量和比例对白酒的风味影响很大。而对于老白干香型白酒和米香型白酒来说，乳酸乙酯含量要多于乙酸乙酯，其中老白干香型的比例为1.5-2.2:1，米香型白酒的乳酸乙酯含量≥0.3g/L，依据GB/T20825规定，老白干香型白酒乳酸乙酯/乙酸乙酯≥0.80。以茅台为代表的酱香型白酒和以汾酒为代表的浓香型白酒，其乳酸乙酯的含量分别达1.4g/L左右。因此乳酸乙酯的含量在白酒中具有重要的意义。乳酸乙酯也是醋等发酵食品的主要香气成分，产乳酸乙酯酵母的应用可以提高食醋中香气成分的含量，改善食醋香气，提高食醋质量。

大多数以纯种培养的酿酒酵母为主体微生物进行的发酵，其特点是发酵周期短、原料出酒率高，但由于酿酒酵母产酯香物质的能力极低，致使成品酒品质较差。而高档饮料酒中酯香物质含量较高的主要原因是采用自然网罗微生物制曲发酵，通过自然制曲网罗的产酯能力较强的汉逊酵母和假丝酵母以及提供产酯前体物的乳酸菌、己酸菌和霉菌等生香微生物来提高酒中各种酯的含量。一方面，这些天然的酵母和提供酯前体的微生物都不具备产乳酸乙酯的能力。另一方面，野生菌群的存在严重影响了原料出酒率，使酒精发酵效率不到酿酒酵母的三分之一，因而导致了我国高档白酒耗粮高、生产周期长、效率低、成本高。

随着白酒工业的现代化发展，酿造技术的机械化越来越受到人们的关注，清洁生产和GMP(良好生产规范)理念逐步在白酒行业应用，白酒行业将迎来重大的变革。白酒生产机械化，一些传统工艺必然改变，酿酒功能菌的生长繁殖和代谢环境及条件亦会随之而变。因此，白酒机械化必须与微生物的研发同步。作为中国白酒的基础风味物质，微生物产酯尤其是对乳酸乙酯的研究更需走在前面。构建高产乳酸乙酯酿酒酵母菌株，使其在发酵过程中保持优良酒精发酵特性的同时生产基础酯香物质乳酸乙酯，对于白酒产品风味特征维持与强化，对于质量提高与稳定，乃至发酵工艺改革，都具有重要意义。

白酒中酯类的生成途径有两种：一种是通过有机反应生成酯，在常温条件下极为缓慢，往往需要经几年时间才能使酯化反应达平衡；另一种就是由微生物的生化反应生成酯，这是白酒生产中产酯的主要途径。存在于酒醅中的汉逊酵母、假丝酵母等微生物，均有较强的产酯能力。近年来关于酿酒酵母产乳酸的报导非常多，Colombie等为提高乳酸脱氢酶基因ldh在菌体中的稳定性，把植物乳酸杆菌(Lactobacellus plantarum)的ldhL1整合到酿酒酵母基因组中，发酵条件优化后重组子的L-乳酸产量达50g/L，为聚乳酸的生产提供大量的前体物质。刘芳志等为了提高表达的稳定性，敲除BAT2的同时过表达南极假丝酵母脂肪酶B，通过外源添加乳酸菌进行混菌发酵，得到高级醇显著降低，乳酸乙酯显著提高的改造菌株。这些研究或者基于存在的乳酸，或者以酿酒酵母为主体的混菌发酵，并没有纯种酵母菌株发酵酿酒原料产乳酸乙酯的研究报道。但是没有在酿酒酵母产乳酸的基础上进行产乳酸乙酯改造的研究。

发明内容：