[发明专利]一种高效的重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法

说明书

本发明公开了一种高效的重组鸭β‑防御素‑2蛋白的生产方法，其选用含有1％酵母浸出物、2％蛋白胨、1％甘油的YPG发酵培养基和选用含有1％酵母浸出物、2％蛋白胨、1％甲醇的YPM诱导表达培养基分别进行摇瓶培养，装载量为10％，接种量为10％，生长期控温30℃，诱导表达期控温25℃，24h甲醇浓度为1％，培养周期为96h。本发明针对现有技术中重组鸭β‑防御素‑2蛋白的摇瓶培养进行培养条件优化，具体地优化了培养基成分、温度、装液量和甲醇浓度几个培养条件，从而有效获得更多的重组鸭β‑防御素‑2蛋白，大大提高了摇瓶培养生产重组鸭β‑防御素‑2蛋白的效率，进而为日后大规模发酵生产打下基础。

技术领域

本发明涉及生物医药领域，特别涉及一种重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法。

背景技术

防御素(defensin)是脊椎动物PMN(polymorphonuclear，多形核白细胞)细胞颗粒中的重要的阳离子抗菌肽，属于抗菌肽的一种，其具有广谱抗菌活性，能有效的杀灭包括细菌和真菌在内的许多病原微生物。在禽类动物体内，只发现β-防御素。自Evans等(1994)从鸡与火鸡异嗜性白细胞中发现β-防御素后，已陆续从鸡、鸭、鸵鸟、鹅和企鹅等体内分离发现到30多个禽β-防御素基因(Lynn等，2004；Soman等，2009；廖文艳等，2009；江龙海等，2008；王瑞琴等；2009)。根据Lynn等(2007)的建议，国际上对禽防御素命名进行了统一规定，所有禽来源的防御素都命名为AvBDs(Avian β-defensins)。

自Soman(2009)最早对鸭β-防御素-2(rDAvBD2)的序列进行了详细的鉴定和功能研究后，近几年开始出现重组AvBD2的基因工程体外表达。Ma等(2009)报道了鸭AvBD2在大肠杆菌中的表达研究，发现其表达产物具有抗菌活性，并对温度和酸碱度有较好的抗逆性。王瑞琴(2009)等也将鸭AvBD2基因在大肠杆菌中高效表达，检测到重组鸭AvBD2对多杀性巴氏杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽胞杆菌、大肠杆菌及猪霍乱沙门氏菌均具有抗菌活性。罗艳娜(2010)证明了鸭AvBD2具有免疫反应活性及促免疫增强作用。韩小凤(2011)等成功克隆鸭AvBD2基因，并在毕赤酵母系统中高效表达，并在体内体外验证了其表达产物的广谱抗菌活性。另有动物试验表明，在饲料中添加适量的鸭AvBD2制剂能促进提高断奶仔猪的生长性能(张辉华等，2011)，促进肉鸭生长性能提高(朱锦兰等，2012)，并对多重耐药性大肠杆菌及沙门氏菌感染肉鸡具有很好的治疗效果(严霞等，2016；严霞等，2017)。

现多采用摇瓶培养的方式实现重组鸭β-防御素-2蛋白的生产，然而其受培养条件的限制而未能有效获得更大量的重组鸭β-防御素-2蛋白。因此如何高效地实现重组鸭β-防御素-2蛋白的大量生产，对重组鸭β-防御素-2蛋白在饲料中的应用具有重大意义。

发明内容

本发明的目的在于针对上述现有摇瓶生产技术的不足，提供一种高效的重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法，旨在为下一步大规模发酵生产奠定基础。

本发明所采取的技术方案是：

一种高效的重组鸭β-防御素-2蛋白的生产方法，其选用含有1％酵母浸出物、2％蛋白胨、1％甘油的YPG发酵培养基和选用含有1％酵母浸出物、2％蛋白胨、1％甲醇的YPM诱导表达培养基分别进行摇瓶培养，培养周期为96h。

其中YPG发酵培养基培养为生长期，装载量为10％，接种量为10％，选用500mL摇瓶装入50mL YPG发酵培养基，同时控温30℃、转速230r/min摇瓶培养24h，加入100％甲醇至终浓度为1％(v/v)；YPM诱导表达培养基培养为诱导期，于生长期结束后离心弃上清再加入YPM诱导表达培养基继续摇瓶培养72h，控温25℃、转速为230r/min，并于48h和72h加入100％甲醇至终浓度为1％(v/v)。