[发明专利]一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法

说明书

本发明公开了一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法，包括以下步骤：（1）健康悬浮sf9昆虫细胞作为转染受体细胞，铺设6孔板；（2）采用无内毒素质粒提取试剂盒，提取重组转移载体质粒；（3）采用qBac‑IIIG杆粒和重转移载体P1064质粒体系进行重组杆状病毒拯救载体；（4）采用Sinofection转染试剂辅助将qBac‑IIIG杆粒和重组转移载体P1064转入健康悬浮sf9昆虫细胞中，获得重组杆状病毒。本发明利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒方法的建立，具有以下有益效果：可利用悬浮SF9昆虫细胞进行转染，转染效率高，通过荧光显微镜早期可以直接判断转染是否成功及转染效率，为疫苗行业高效获得重组杆状病毒表达疫苗抗原工作打下了工作基础。

技术领域

本发明涉及生物基因工程领域，具体说是一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法。

背景技术

自利用苜蓿银纹夜蛾核多角体病毒(AcNPV)在草地贪夜蛾Laphygma frugiperda细胞Sf9中表达出人β-干扰素以来,作为当今基因工程四大表达系统之一的杆状病毒表达载体系统因其独特的优点和巨大发展潜力,日益受到各国学者重视。疫苗研究方面:由于昆虫杆状病毒表达系统表达的产物成本低、表达量高、构像接近天然蛋白等特点,在疫苗研制中显示了诱人前景。另外杆状病毒可以容载大片段外源基因而使多个基因共表达,这使其在疫苗研究中更具优势,被认为是表达病毒样颗粒(virus-like particle,VLP)的最佳表达系统。

但不同昆虫杆状病毒表达体系中前期重组杆状病毒获得，均有以下缺点：

1.无法评判转染效率，只能通过杆粒转染后4-6天后细胞出现明显病变后判定转染是否成功重组杆状病毒；

2.转染细胞受体基本全部采用贴壁sf9昆虫细胞，贴壁sf9昆虫细胞生长缓慢，培养周期长；

3.因sf9细胞本身特性，转染效率较低，导致F0代重组杆状病毒含量少，F1扩大培养病毒滴度低，需要进行再次扩大培养；

4.因杆粒及转移载体质粒无法保证严格无菌以及转染操作因素，经常细胞污染导致转染失败；

5.因提取质粒带有细菌内毒素原因，引发sf9细胞死亡，导致转染失败。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是提供一种利用sf9悬浮昆虫细胞高效率获得重组杆状病毒的方法，本发明的目的之一是提供一种sf9悬浮昆虫细胞高效率转染的方法；本发明的目的之二是提供一种可以判断转染效率的昆虫细胞转染体系；本发明的目的之三是提供一种有效降低因细胞污染等因素导致的转染失败的方法。

为解决上述技术问题，本发明的技术方案是：

为实现上述发明目的之一，本发明是通过以下技术方案实现的：

1.复活含有转移载体的菌液，提取重组转移载体质粒，严格按无内毒素质粒提取试剂盒说明书进行，最后用无菌水(ph8.0)洗脱，EP管灭菌；

2.准备昆虫细胞sf9，健康悬浮sf9昆虫细胞传代培养至24 h，利用悬浮昆虫细胞无血清培养基VIGOR-S100将细胞密度稀释至1×106 cell/ml，6孔板每孔加入1 ml细胞，静置培养3 h；

3. 1 μlqBac-IIIG杆粒和3 μl重组转移载体P1064混匀后，用无菌生理盐水稀释至100μl，3.5 μlSinofection转染试剂用无菌生理盐水稀释至100 μl，静置10 min。

4.将上述杆粒与重组转移载体混合物逐滴加入Sinofection转染试剂生理盐水溶液中，静置20 min后；

5.用无菌生理盐水补齐600 μl，加入到PBS清洗一次的6孔板sf9细胞孔中，26 ℃孵育2h；