[发明专利]杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物及其可视化检测方法和应用

说明书

本发明提供了一种杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物及其可视化检测方法和应用。本发明设计了一种杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物，包括外引物F3和B3，以及内引物FIP和BIP，见序列表。基于该引物建立的杧果小孢拟盘多毛孢病菌检测方法，经过LAMP恒温扩增后显色反应或琼脂糖凝胶电泳检测，可观察到绿色荧光或出现LAMP特征性的梯形条带。所发明的LAMP检测引物及其检测方法能在生产实践中实现杧果小孢拟盘多毛孢病菌的快速、灵敏、准确检测，同时可用于田间杧果拟盘多毛孢叶斑病的早期诊断和病菌的监测、鉴定，为杧果拟盘多毛孢叶斑病的早期预警和防控提供可靠的技术和理论依据。

技术领域

本发明涉及一种杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物及其可视化检测方法和应用，专用于杧果小孢拟盘多毛孢病菌的快速可视化检测，可实现田间杧果拟盘多毛孢叶斑病的早期诊断和病菌的监测、鉴定，属于农作物病害检测、鉴定及防治领域。

背景技术

杧果(Mangifera indica L.)为世界著名的热带果树，属漆树科。杧果果实含有糖、蛋白质、粗纤维，杧果所含有的维生素A的前体胡萝卜素成分特别高，是所有水果中少见的。其次，维生素C含量也较高，矿物质、蛋白质、脂肪、糖类等也是其主要营养成分。杧果拟盘多毛孢叶斑病是由拟盘多毛孢属(Pestalotiopsis spp.)为害造成的重要的杧果叶部病害，造成叶片枯死，树势衰弱。据报道，Pestalotiopsis calabae、P.mangiferae、P.congensis、P.annulata和P.funerea均可为害杧果造成灰斑病或叶斑病，本发明通过调查研究发现小孢拟盘多毛孢(P.microspora)造成杧果叶斑病，为害叶片和嫩稍，为害叶片形成圆形至不规则形病斑，后病斑处叶片灰褐色枯死，为害嫩稍，造成嫩稍上叶片褐色枯死，最后嫩稍枯死，严重时造成50％以上的产量损失，这是小孢拟盘多毛孢(P.microspora)为害杧果的首次报道。小孢拟盘多毛孢造成的杧果叶斑病与拟盘多毛孢属其他种如Pestalotiopsis calabae、P.mangiferae、P.congensis、P.annulata和P.funerea造成的病害症状相似，病原菌的形态特征也较相似，另外与炭疽病(Colletotrichumgloeosporioides)、灰斑病(Cercospora mangiferae)等多个病害的症状也相似，难以从病害症状上明确病原菌，因此要断定造成杧果叶斑病的病原菌需要采用柯赫氏法则经过病原菌分离培养、病原菌鉴定、接菌、症状分析加以确定，而这整个流程耗时长、效率低，难以做到及时检测和有效控制病原菌的传播和病害流行，难以满足杧果拟盘多毛孢叶斑病诊断的实际需要，因此迫切需要建立一套方便快捷、结果可靠、灵敏度高的快速诊断技术。

近年来，分子生物学技术发展迅速，随着分子生物学技术在植物病理学科不断发展和应用，一些分子标记技术为植物病原菌的诊断检测提供了新的途径，PCR(polymerasechain reaction)技术以特异性强、灵敏度高、方便快捷等特点被用于植物病原菌的诊断，但其需要昂贵的仪器设备，难以在基层部门实现快速、准确的检测。环介导等温扩增(loop-mediated isothermal amplification,LAMP)技术是由日本科学家Notomi等开发的一种简便、快速、准确、高效的核酸恒温扩增方法。该技术在等温条件下短时间内实现大量扩增，30min-60min内实现10⁹-10¹⁰倍的扩增，具有很高的灵敏性和特异性，且操作简便，检测结果可肉眼判断。相比PCR技术，LAMP技术全程恒温反应，无需PCR仪，且扩增量大灵敏度高。

发明内容

针对没有现有技术对杧果小孢拟盘多毛孢病菌开展检测和鉴定的现状，本发明提供了一种杧果小孢拟盘多毛孢病菌LAMP检测引物及简便、快捷、灵敏、特异的可视化检测方法。

本发明的目的通过如下技术方案实现：