[发明专利]MiR-210在胶质瘤中相关靶点验证的实验方法

说明书

本发明公开了MiR‑210在胶质瘤中相关靶点验证的实验方法，其特征为，括如下步骤：利用胶质瘤细胞系，分别构建miR‑210过表达细胞组、miR‑210低表达细胞组及空质粒细胞组，通过real‑time qPCR，western blotting实验检测miR‑210对下游基因的影响程度，检测靶点蛋白和其基因的表达水平。并通过MTT、侵袭、迁移等试验明确miR‑210的相关生物学作用。并且通过报告基因明确靶点是否正确。

技术领域

本发明涉及MiR-210在胶质瘤中相关靶点验证的实验方法。

背景技术

人脑胶质瘤是中枢神经系统最常见的肿瘤，约占成人颅内肿瘤的40％-50％。目前临床主要采用手术并辅以放疗、化疗等综合治疗。但胶质瘤病人(尤其是胶质母细胞瘤)的治疗效果仍不理想，病死率和复发率仍旧很高，是预后最差的肿瘤之一。近年来，尽管显微神经外科技术以及相关辅助治疗手段有了极大的提高，但治疗效果依然不佳，这主要与人脑胶质瘤快速的生长、浸润、侵袭及耐药有关，但其中的机制还不清楚。探讨胶质瘤的发病机理、明确其如何快速生长和侵袭的机制，一直是神经外科研究领域比较热门的话题。

目前的研究来看，肿瘤侵袭性主要涉及以下三个方面：(1)肿瘤细胞的黏附与迁移；(2)细胞外基质的降解(3)肿瘤新生血管的生成。胶质瘤的快速生长往往使肿瘤细胞处于缺氧的环境下，在缺氧环境下胶质瘤如何生长并且怎样继续向周围正常脑组织侵袭浸润的，目前的研究提示可能与肿瘤新生血管的生成有关，目前的研究提示HIF-1通路在缺氧环境下调节肿瘤新生血管的生成中起重要作用。缺

氧诱导因子-l(Hypoxia inducibIe factor-l，HIF-l)是由Semenzal993年在缺氧诱导的细胞核提取物中发现的一种转录因子，缺氧条件下广泛存在于哺乳动物和人体细胞中，由HIF-lα和HIF-lα构成异二聚体，其中HIF-lα是主要的氧调节亚基[5]。HIF-lα可和缺氧适应有关基因如血管内皮生长因子(VEGF)等的启动子或增强子上的HIF-l结合位点结合，促进这些基因的转录。人类实体肿瘤中常存在缺氧环境，已在多种恶性肿瘤及癌前病变中检测到HIF-lα蛋白的过度表达，正常组织及良性病变中则无表达。在肿瘤发生早期即血管形成及侵袭发生之前即可发生HIF-lα的过度表达，且与肿瘤生长、血管形成、侵袭转移有关。已证实HIF-lα在缺氧介导的凋亡中及肿瘤细胞增殖起重要作用。在人脑胶质瘤中HIF-1α通路同样发挥重要作用。MicroRNAs(miRNAs)是一类由17～27个核苷酸组成的内源性非编码小RNA，通过结合目的基因mRNA 3`非编码区，使目的基因mRNA降解或抑制mRNA翻译。迄今为止，发现的人类miRNAs超过2000个(http://www.mirbase.org/)。它们涉及许多相关的生物学进程，包括细胞增殖、分化、细胞周期调节等；同时在肿瘤分子病理学中也有许多应用，包括：肿瘤发生、分化、增值、细胞周期调节、血管生成、趋化、迁移、侵袭和凋亡。而其中研究与缺氧有关的miRNA有miR-210、miR-20a、miR-20b、miR-214、miR-138、miR-145和miR-503等。我们前期研究中发现miR-210在人脑胶质瘤中受HIF-lα，并且发挥调节细胞侵袭的作用。MiR-210是染色体编号11p15.5区域的转录产物(http://www.microma.org/microma/)，与许多肿瘤缺氧下的生长、血管生成、侵袭和凋亡有密切关系。目前的研究结果提示，miR-210在多种肿瘤中都发挥着重要作用。Rothe等人指出miR-210与乳腺癌的增殖、转移、侵袭和较差的临床预后相关，可以作为预测乳腺癌临床结果的潜在生物学指标[14]。Camps等人报道了缺氧诱导的miR-210在乳腺癌中作为独立诊断因子，其表达水平与无病生存期和总体生存期呈现负相关，在单变量和多变量分析中尤为明显。此外,miR-210不仅仅与乳腺癌的预后有关，而且在乳腺癌转移侵袭方面也起重要作用。胰腺癌中，HIF-lα诱导产生miR-210，并且miR-210与患者的预后具有密切关系。MiR-210在肾透明细胞癌(CCRCC)中主要接受HIF-1调节，但当HIF-1缺失时，也接受HIF-2的调节。ISCU作为miR-210的靶点，其表达与miR-210呈现负相关。另外,miR-210在CCRCC中的表达与较好的临床预后以及肿瘤的低分期低分级相关联，这是意料之外的，因为很多研究报道都显示miR-210在肿瘤中的表达与较差的临床预后相关联。茶多酚(EGCG)能够阻止HIF-1α羟基化依赖的泛素化和随后的蛋白酶体介导的降解，从而诱导miR-210在肺癌中的表达，而miR-210的过表达能够影响肺癌细胞增殖和生长，并且miR-210的高表达预示较差的预后。在琥珀酸脱氢酶(SDH)突变型头颈部副神经节瘤(HNPGLs)中,SDH的功能失调诱导HIF不稳定表达。Merlo等发现低氧可以诱导HIF-lα的表达，然后HIF-lα诱导肿瘤细胞过表达miR-210，进而调节下游靶点ISCU的低表达，从而形成了一个HIF-1α/miR-210/ISCU信号轴，与SDH突变型HNPGLs的发病机理密切相关。MiR-210在卵巢癌中接受HIF信号通路调控，低氧诱导miR-210的表达上调，进而抑制其下游靶点E2F3的表达，在肿瘤发生中作为低氧应答的重要调节因子而起重要作用。肝癌中，低氧/miR-210/血管膜蛋白1(VMP1)通路被证明在肝癌细胞低氧生存及侵袭中发挥重要作用，为消灭低氧环境下生存的肝癌细胞发挥重要价值。Greither等人研究发现miR-210在软组织肉瘤(STS)中的表达与性别和肿瘤发病年龄有关。