[发明专利]一种HBV DNA定量检测方法

权利要求书

1.一种HBV DNA定量检测方法，其特征在于，包括：

步骤一：相关试剂配制；

步骤二：取0.6m1离心管N个，N＝阴性对照+高值质控品+低值质控品样本数量，分别编号；加入100ul样品处理液A到0.6ml离心管中；取待测样本、阴阳性对照品及质控品各100ul,分别加到0.6ml离心管中，加入25u1样品处理液B,振荡混匀,100℃干浴10min,振荡混匀,13000rpm离心10min(离心时注意固定离心管方向，吸弃上清，13000r pm离心3min,取出震荡混匀后再13000r pm离心5min,保留上清备用；

步骤三：若样本及对照品裂解产物保存在-20℃,使用前置室温解冻,以13000rpm离心5min向分装好反应液中加入处理好的DNA模板以及阳性参控品各2ul,盖紧PCR反应管管盖,并编至扩增和产物分析区；

步骤四：对所述步骤三得到的样本进行PCR扩增；

步骤五：结果分析与判断。

2.根据权利要求1所述的HBV DNA定量检测方法，其特征在于，所述步骤五中结果分析包括：基线的确定:取4～10个循环的荧光信号，可需根据当日结果曲线调整基线；

阈阅值设定:为刚好超过正常阴性对照扩增曲线；阈值的设定必须在指数增长期；应选在标准曲线间隔均匀处。

3.根据权利要求2所述的HBV DNA定量检测方法，其特征在于，所述步骤五中结果判断包括：

检测样本中5.00E+02IU/ml≤HBV DNA<2.72E+08IU/ml,测定结果有效,直接报告相应的拷贝定性检测报告阳性；

若检测样本中HBV DNA≥2.72E+08IU/m1,需用正常人血清301倍稀释,使其拷贝数范围落在10⁴～10⁷IU/m1范围内再重新测定,报告结果时应在测得结果基础上乘以301,并填写《超出线性范围的样本复查记录》，如为定性检测直接报为阳性；

检测样本HBV DNA<5.00E+02IU/m1时,报告为<5.00E+02IU/m1，定性检测时报告阴性；

Ct值无数值时,报告为<5.00E+02IU/ml，定性检测报告阴性。

4.根据权利要求3所述的HBV DNA定量检测方法，其特征在于，将反应管瞬时离心后放入ABI7300荧光定量PCR仪中，在SDS软件中编号,编号应与PRD系统接收标本时生成的实验号一致，并设好各工作标准品参数，将报告荧光设定为FAM,淬灭荧光设为none,参比荧光设定为none。

5.根据权利要求4所述的HBV DNA定量检测方法，其特征在于，所述步骤四的PCR扩增的循环次数为36-45次，循环条件为：50℃、2min；94℃、2min；94℃、10sec；60℃、30sec；35℃、10sec。

6.根据权利要求1所述的HBV DNA定量检测方法，其特征在于，所述步骤一包括：从试剂盒中取出PCR反应液,室温融化后，约1小时，漩涡混匀,2000rpm离心数秒；计算所需要分装的管数n，n＝样本数+1管阴性对照+1管空白对照+1管高值质控品+1管低值质控品+6阳性参控品，向n个PCR反应管中分别加入28ulPCR反应液,转移至样本处理区。