[发明专利]一种应用RPA技术检测南方根结线虫的引物和探针

说明书

本发明的目的是提供1套基于RPA技术检测南方根结线的引物和探针，其中1对引物如SEQ ID No:3和SEQ ID No:4所示，探针序列如SEQ ID No:9所示。利用本发明的引物和探针进行RPA反应和侧向流试纸条快速检测，可以摆脱传统分子检测对PCR仪等昂贵仪器和严格反应条件的限制，快速、高效鉴定南方根结线虫，结果肉眼即可观察，在南方根结线虫的早期和田间诊断、辅助鉴定方面有很高的应用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及到一种检测南方根结线虫的引物和探针。 即应用重组酶聚合酶等温扩增技术(Recombinase Plolymerase Amplification，RPA) 技术进行扩增，扩增产物使用侧向流试纸条(Lateral Flow Strips)快速检测南方 根结线虫的引物、探针和检测方法。

背景技术

根结线虫(Meloidogyne spp.)是严重危害农业生产的一类植物寄生线虫， 其分布范围广，寄主植物达3000多种，每年在世界范围内造成的经济损失达百 亿美元，其中分布范围最广的是南方根结线虫(M.incognita)。近年来，随着我 国设施栽培规模的扩大，根结线虫在果树、蔬菜、花卉、中药材等旱地作物上的 为害逐年加重，在安徽、山东、江苏、新疆、深圳等地蔬菜产区根结线虫发病率 达60％以上，已经严重制约了我国蔬菜等经济作物的安全生产。

目前根结线虫的检测方法主要有形态鉴定、传统PCR检测以及LAMP检 测等。其中，形态检测对检测人员的形态学背景要求较高，需要借助高倍的显微 镜，且检测速度较慢，而传统PCR检测技术虽然大大加快了检测的速度，但由 于其需要PCR仪等高精尖仪器设备，且检测时间较长，其应用也受到限制，主 要适用于实验室内检测；LAMP检测技术的出现使分子检测摆脱了对精密仪器的 需求，也更利于一些基层技术人员应用。RPA((RecombinasePolymerase amplifcation)是一项利用重组酶聚合酶等温扩增的技术，该技术不仅可以摆脱对 高值仪器的需求，而且相比LAMP检测技术，其反应时间更短，且扩增后产生 与传统PCR一样的单一条带，通过结合探针和侧向流试纸条(Lateral Flow Strips)， 可以实现病原物高特异性、高灵敏度的快速检测。

发明内容

本发明的目的是提供一种应用RPA技术检测南方根结线虫的特异性引物和 探针，摆脱传统分子检测对高值仪器和专业技术人员的依赖，实现对南方根结线 虫的快速检测，弥补现有技术的不足。

本发明提供的检测南方根结线虫的引物和探针，其正向引物序列如SEQ ID No:3所示，反向引物如SEQ ID No:4所示，探针序列如SEQ ID No:9所示。

所述反向引物的5’端标记生物素Biotin基团；所述探针5’端标记荧光素 FITC基团，第32位的胞嘧啶被替换为dSpacer，3’端的标记C3Spacer。

本发明还提供了一种基于重组酶聚合酶等温扩增技术(RPA)检测南方根结 线虫的方法：RPA反应使用nfo kit，反应总体系为50μl，首先在0.2ml 的PCR管中加入缓冲液29.5μl，10μM的上下游引物各2.1μl，10μM的探针0.6μl， DNA模板1μl，ddH₂O 12.2μl，混匀后，加入到含有RPA冻干酶粉的反应管中混 匀，加入280mM的MgAc液2.5μl，将反应管置于金属浴中，39℃反应30分钟， 反应产物使用侧向流试纸条进行检测。

本发明根据通过比对不同根结线虫基因组序列设计了多个RPA引物，从中 筛选出可快速有效检测南方根结线虫的引物，并进一步设计了适用于PA的探针， 利用该套引物和探针，以南方根结线虫DNA为模板进行反应后，使用侧向流试 纸条检测，阳性指示条带和质控条带均显色，而以其他种类线虫DNA为模板进 行反应后，侧向流试纸条仅质控条带显色，表明本发明提供的RPA检测方法特 异性高；同时，本发明提供的RPA检测方法与普通PCR检测方法灵敏度相当。

附图说明